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动物细胞/组织细胞色素C释放比色法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间:2026/8/10 14:14:33      阅读次数:21

动物细胞/组织细胞色素C释放比色法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

动物细胞/组织细胞色素C释放比色法定量检测试剂是一种旨在从动物细胞或活体组织中分离出线粒体和细胞浆组分,从而检测细胞色素C的转运,即由线粒体释放到细胞浆,通过分光光度仪,来定量测定细胞色素C的浓度变化的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞的线粒体和细胞浆组分中细胞色素C的检测。产品不含污染性蛋白水解酶,即到即用,性能稳定,分离到位,检测敏感。

 

技术背景

细胞色素CCYTOCHROME C)在细胞凋亡中扮演着重要作用。细胞色素C位于线粒体内外膜之间。当细胞凋亡时,它从线粒体内释放到细胞浆里,引起一系列的信号通道的下游反应。

 

产品内容

清理液(Reagent A   毫升

裂解液(Reagent B   毫升

净化液(Reagent C   毫升

强化液(Reagent D   毫升

保存液(Reagent E   毫升

活性液(Reagent F   微升

缓冲液(Reagent G   毫升

氧化液(Reagent H   微升

还原液(Reagent I   

稀释液(Reagent J   毫升

产品说明书   1

 

保存方式

保存净化液(Reagent C)和活性液(Reagent F)在-20冰箱里,避免反复冻融;其余的保存在4冰箱里有效保证6

 

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液(G&VS12028)或PBS缓冲溶液(G&VS12033):用于清理细胞

硬组织处理液(Reagent K):用于促进硬组织表面溶解(另购)

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(G&VS12024):用于细胞脱离

完全细胞培养液(G&VS12052):用于细胞培养所需的培养基

15毫升锥形离心管:用于线粒体初步制备物的存放

50毫升锥形离心管:用于细胞或组织收集后离心或清洗

1.5毫升离心管:用于保存线粒体

4℃(微型)台式离心机:用于沉淀细胞

4℃超速离心机:用于分离细胞器成分

DOUNCE匀浆器:用于裂解细胞

比色皿:用于比色的容器

分光光度仪:用于比色分析

 

实验步骤

一、 样品制备

 

操作一、动物软组织线粒体分离(组织匀浆法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent Fxx毫升净化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(xx克组织需要xx毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 即刻用刀片切碎组织

5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

7. 涡旋震荡5秒,充分混匀

8. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下)(注意:参见注意事项5

9. 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

10. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

11. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

12. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为10000g

13. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分

14. 即刻置入-70℃冰箱里备用

15. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

16. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

17. 涡旋震荡15

18. 置入冰槽中孵育15分钟

19. 涡旋震荡60

20. 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

21. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

22. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

23. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

 

操作二、动物软组织线粒体分离(化学处理法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent F xx毫升净化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(xx克组织需要xx毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 移入一个液氮冻存管

5. 即刻放进液氮罐过夜

6. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)碾碎组织成粉末(注意:切莫使组织冻融

7. 放进一个15毫升锥形离心管

8. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

9. 涡旋震荡5秒,充分混匀

10. 在冰槽里孵育2分钟,期间涡旋震荡5秒一次

11. 加入预冷的xx微升强化液Reagent D

12. 涡旋震荡5秒,充分混匀

13. 在冰槽里孵育5分钟,期间涡旋震荡5秒二次(注意:参见注意事项6

14. 加入预冷的xx毫升保存液(Reagent E,用手混匀

15. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

16. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

17. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为10000g

18. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分

19. 即刻置入-70℃冰箱里备用

20. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

21. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

22. 涡旋震荡15

23. 置入冰槽中孵育15分钟

24. 涡旋震荡60

25. 放进4微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

26. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

27. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

28. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

操作三、动物细胞线粒体分离(细胞匀浆法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent F xx毫升净化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 准备51075cm2细胞培养瓶的细胞(5 X 107),直至细胞生长铺满整个培养表面

2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶,覆盖培养瓶表面,然后抽去

3. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养平面

4. 置入37培养箱3分种

5. 手击振动培养瓶,使细胞脱落

6. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

7. 合并移入到150毫升锥形离心管

8. 放进台式离心机离心10分钟,速度为200g

9. 小心抽去上清液

10. 加入xx毫升预冷的清理液(Reagent A),混匀细胞

11. 放进台式离心机离心10分钟,速度为300g

12. 小心抽去上清液

13. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

14. 涡旋震荡5秒,充分混匀细胞颗粒群

15. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用研磨棒匀化细胞(约80下)(注意:参见注意事项5

16. 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

17. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为1500g

18. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

19. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g

20. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分

21. 即刻置入-70℃冰箱里备用

22. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

23. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

24. 涡旋震荡15

25. 置入冰槽中孵育15分钟

26. 涡旋震荡60

27. 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

28. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

29. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

30. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

操作四、动物细胞线粒体分离(化学处理法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent F xx毫升净化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 准备51075cm2细胞培养瓶的细胞(5 X 107),直至细胞生长铺满整个培养表面

2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶,覆盖培养瓶表面,然后抽去

3. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养平面

4. 置入37℃培养箱3分种

5. 手击振动培养瓶,使细胞脱落

6. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

7. 合并移入到150毫升锥形离心管

8. 放进台式离心机离心10分钟,速度为200g

9. 小心抽去上清液

10. 加入xx毫升预冷的清理液(Reagent A

11. 放进台式离心机离心10分钟,速度为300g

12. 小心抽去上清液

13. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

14. 涡旋震荡5秒,充分混匀

15. 在冰槽里孵育2分钟,期间涡旋震荡5秒一次

16. 加入预冷的xx微升强化液Reagent D

17. 涡旋震荡5秒,充分混匀

18. 在冰槽里孵育5分钟,期间涡旋震荡5秒二次(注意:参见注意事项6

19. 加入预冷的xx毫升保存液(Reagent E,用手混匀

20. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为1500g

21. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

22. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g

23. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分

24. 即刻置入-70℃冰箱里备用

25. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

26. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

27. 涡旋震荡15

28. 置入冰槽中孵育15分钟

29. 涡旋震荡60

30. 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

31. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

32. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

33. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

操作五、动物硬组织线粒体分离(组织匀浆法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent F xx毫升净化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(xx克组织需要xx毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 即刻用刀片切碎组织

5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6. 加入预冷的xx毫升硬组织处理液(Reagent K,充分混匀

7. 放进冰槽里孵育3分钟

8. 放进4℃台式离心机离心2分钟,速度为1000g

9. 小心抽去上清液

10. 加入预冷的xx毫升清理液(Reagent Axx毫升 净化液(Reagent C,充分混匀

11. 放进4℃台式离心机离心2分钟,速度为1000g

12. 小心抽去上清液

13. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

14. 涡旋震荡5秒,充分混匀

15. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下)(注意:参见注意事项5

16. 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

17. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为1500g

18. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

19. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g

20. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分

21. 即刻置入-70℃冰箱里备用

22. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

23. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

24. 涡旋震荡15

25. 置入冰槽中孵育15分钟

26. 涡旋震荡60

27. 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

28. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

29. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

30. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

 

操作六、动物硬组织线粒体分离(化学处理法)

实验开始前,将试剂盒里的活性液(Reagent F冻融,然后移出xx微升活性液(Reagent Fxx毫升净化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,置入冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(xx克组织需要xx毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 移入一个液氮冻存管

5. 即刻放进液氮罐过夜

6. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)碾碎组织成粉末(注意:切莫使组织冻融

7. 放进一个15毫升锥形离心管

8. 加入预冷的xx毫升硬组织处理液(Reagent K,充分混匀

9. 放进冰槽里孵育3分钟

10. 放进4℃台式离心机离心2分钟,速度为1000g

11. 小心抽去上清液

12. 加入预冷的xx毫升清理液(Reagent Axx毫升 净化液(Reagent C,充分混匀

13. 放进4℃台式离心机离心2分钟,速度为1000g

14. 小心抽去上清液

15. 加入预冷的xx毫升裂解工作液

16. 涡旋震荡5秒,充分混匀

17. 在冰槽里孵育2分钟,期间涡旋震荡5秒一次

18. 加入预冷的xx微升强化液Reagent D

19. 涡旋震荡5秒,充分混匀

20. 在冰槽里孵育5分钟,期间涡旋震荡5秒二次(注意:参见注意事项6

21. 加入预冷的xx毫升保存液(Reagent E,用手混匀

22. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为1500g

23. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

24. 放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g

25. 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――步骤获得细胞浆组分

26. 即刻置入-70℃冰箱里备用

27. 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

28. 加入xx微升保存液(Reagent E到线粒体颗粒样品中

29. 涡旋震荡15

30. 置入冰槽中孵育15分钟

31. 涡旋震荡60

32. 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415R

33. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

34. 若暂时不予后续处理,即刻保存在-70℃冰箱里备用

35. 或分别移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-G&VS30030.1

二、比色测定

实验开始前,移出xx毫升稀释液(Reagent J还原液(Reagent I管里,混匀后,标记为还原工作液置于冰槽里备用(注意:用完后即刻放回20冰箱里)

 

操作一、背景对照测定

1. 设定好分光光度仪:温度25℃,波长550nm,并置零

2. 移取xx微升缓冲液(Reagent G到新的1毫升比色皿

3. 加入xx微升氧化液(Reagent H

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 即刻放进分光光度仪检测,此为氧化型背景空对照(注意:通常0.1

6. 取出比色皿

7. 加入xx微升还原工作液

8. 上下倾倒数次,混匀

9. 即刻放进分光光度仪检测,此为还原型背景空对照

 

操作二、样品测定

1. 70℃冰箱里取出待测样品,置于冰槽里融化

2. 移取xx微升缓冲液(Reagent G到新的比色皿

3. 加入100微升待测样品(注意:参见注意事项15

4. 加入xx微升氧化液(Reagent H

5. 上下倾倒数次,混匀

6. 即刻放进分光光度仪检测,此为氧化型样品读数

7. 取出比色皿

8. 加入xx微升还原工作

9. 上下倾倒数次,混匀

10. 即刻放进分光光度仪检测,此为还原型样品读数

11. 计算样品浓度:

注意事项

1. 本产品为10次操作(1克动物组织或5 X 107细胞)包括20次比色测定

2. 所有操作均须在4℃或以下状态下进行

3. 操作时,须戴手套

4. 操作时,须无菌操作,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B保存液(Reagent E

5. 通常匀化次数为80下达到80%的细胞裂解为理想状态,但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度:完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加匀化次数

6. 通常孵育5分钟达到80%的细胞裂解为理想状态,但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度:完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

7. 对于难以裂解的细胞,例如HeLa细胞,采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理

8. 5 X 107细胞约1克重量

9. 建议使用足够的细胞量

10. 建议严格控制操作时间

11. 通常5 X 107细胞或1克动物组织的线粒体含量至少50微克线粒体蛋白

12. 建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒(G&VS30030.1)测定蛋白浓度

13. 保存在-70℃冰箱里的蛋白样品严格避免反复冻融

14. 建议还原工作液新鲜配制使用为佳

15. 比色测定后,比色皿须清洗彻底,否则干扰后续检测

16. 避免试剂交叉污染

17. 样品还原型读数越高,细胞色素C含量越高

18. 建议待测样本线粒体蛋白浓度至少为2微克总量;胞浆蛋白浓度至少为50微克总量;如果样本细胞色素C浓度过低或过高,则可以增加或降低样本量

19. 处理硬组织样品需要另购20毫升净化液(Reagent C50毫升硬组织处理液(Reagent K

20. 本公司提供系列细胞色素C试剂产品

 

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶

3. 本产品经鉴定检测敏感

 

使用承诺

上海极威生物科技有限公司秉着信誉至上、客户满意、质量承诺的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司联系,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。

 

友情提醒

IF IT DOESN’T WORKRECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG

 

订购信息

单组分订购信息

编号 名称 规格

G&VS10120.2 动物细胞/组织细胞色素C释放比色法定量检测试剂 10

G&VS10120.2A 清理液(Reagent A 毫升

G&VS10120.2B 裂解液(Reagent B 毫升

G&VS10120.2C 净化液(Reagent C 毫升

G&VS10120.2D 强化液(Reagent D 毫升

G&VS10120.2E 保存液(Reagent E 毫升

G&VS10120.2F 活性液(Reagent F 毫升

G&VS10120.2G 缓冲液(Reagent G 毫升

G&VS10120.2H 氧化液(Reagent H 毫升

G&VS10120.2I 还原液(Reagent I

G&VS10120.2J 稀释液(Reagent J 毫升

G&VS10120.2K  硬组织处理液(Reagent K 毫升

G&VS12028 HANK平衡盐溶液 毫升

G&VS12033 PBS溶液 毫升

G&VS12024 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液 毫升

G&VS12052 DMEM完全细胞培养基 毫升

G&VS30030.1 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 100

 

 

 

 

试剂盒订购信息

 

产品编号

名称

规格

G&VS10042.1.1

动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒

10

G&VS10042.1.2

动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒(含抗体)

10

G&VS10042.2.1

植物细胞色素C释放凋亡检测试剂盒

10

G&VS10042.2.2

植物细胞色素C释放凋亡检测试剂盒(含抗体)

10

G&VS40071.1

石蜡切片组织细胞色素C免疫组织化学检测试剂盒

10/20

G&VS40071.2

石蜡切片组织细胞色素C免疫荧光检测试剂盒

10/20

G&VS40072.1

冰冻切片组织细胞色素C免疫组织化学检测试剂盒

10/20

G&VS40072.2

冰冻切片组织细胞色素C免疫荧光检测试剂盒

10/20

G&VS40073.1

细胞样品细胞色素C免疫组织化学检测试剂盒

10/20

G&VS40073.2

细胞样品细胞色素C免疫荧光检测试剂盒

10/20

G&VS10120.2

动物细胞/组织细胞色素C释放比色法定量检测试剂盒

10

G&VS10014.2

纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

20

G&VS10014.3

细胞/组织悬液细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

20

G&VS10014.4

纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

20

G&VS10014.5

真菌/酵母细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

20

G&VS10014.6

植物细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

20

 

 


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