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发布时间：2026/8/21 13:50:45 阅读次数：43
铜离子膜通道转运功能（P型ATP酶）绿色荧光检测试剂盒产品说明书
主要用途
铜离子膜通道转运功能（P型ATP酶）绿色荧光检测试剂是一种旨在使用铜离子荧光探针，自由进入囊泡内或细胞内，一旦铜离子进入产生荧光淬灭，来分析和观察铜离子转运功能，进一步评价P型ATP酶中的铜ATP酶功能的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体、真菌/酵母、植物细胞或细胞器（高尔基体、线粒体、溶酶体、囊泡、胞浆等）铜离子转运活性，即P型ATP酶的铜ATP酶功能的检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
细胞膜上的膜整合蛋白（integral membrane protein）参与细胞内外的物质传输、能量产生与转化等生物学过程，构成离子或代谢分子的通道，常见的包括氢离子、钠离子、钾离子、重金属离子等，在能量依赖型或非依赖型的条件下，完成生理代谢的物质交换。膜通道转运功能检测（transport或uptake assay）用于分析转运蛋白（transport protein）和底物（substrate）的功能、筛选通道抑制剂、进而发现药物以及抗药性机制。建立分子构建的载体或宿主模型、分离膜性囊泡（membrane vesicle）包括正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）或内侧外翻膜性囊泡（In-side out；IOV），通过标记底物的转运，来定量测定转运活性。铜离子膜通道转运功能，即铜转运P型ATP酶（copper transporting P-type ATPase）或重金属转运P型ATP酶（heavy metal transporting P-type ATPase），分成两种：ATP7A（Menkes病蛋白；Menkes disease protein）和ATP7B（Wilson病蛋白；Wilson disease protein），前者异常导致系统性铜缺陷，而出现神经退行性病变；后者异常导致导致肝脏和脑组织铜堆积，而产生肝硬化和脑变性病变。铜离子作为机体第三大瞬时性必需微量金属（transition metal）和多种酶（细胞色素C氧化酶和过氧化物歧化酶等）的辅因子，通过铜ATP酶，控制铜离子的吸收、聚集、运送、去毒等作用，维持微环境铜离子平衡（浓度为10-18至-13摩尔），实现铜离子的生理功能，包括线粒体电子传导、病原菌防御、植物细胞壁木质化（lignification）、维生素C代谢、固氮、碳水化合物代谢、脂肪酸羟基化和去饱和化等。通过使用铜离子荧光探针Phen Green，一种金属结合性菲咯啉（phenanthroline）二价连接在荧光素上的荧光化合物，自由性进入各种细胞或囊泡（vesicle）内，在ATP的存在下，铜离子转运穿过质膜，与荧光探针结合，使绿色荧光淬灭（激发波长506nm，散发波长530nm），以分析转运蛋白P型ATP酶中铜ATP酶的功能，以及其抑制剂的筛选。
产品内容
缓冲液（Reagent A） 毫升
标记液（Reagent B） 毫升
离子液（Reagent C） 毫升
补充液（Reagent D） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
恒温水槽或培养箱：用于反应孵育
1毫升比色皿：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪：用于荧光定量分析
实验步骤
一、 样品准备
1． 确定测定对象：动物/人体、真菌/酵母或植物
2． 分离膜性囊泡（注意：建议使用系列分离试剂盒产品）：
| 膜性囊泡选择 | 检测目的 |
| RSOV（正常外向膜性囊泡（Right-side out） | 铜离子流入检测（influx或uptake） |
| IOV（内侧外翻膜性囊泡（In-side out） | 铜离子外流检测（efflux） |
3． 准备好待测的分离样品，置于冰槽里备用
二、 测定准备
1． 开启并设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长为506nm，散发波长530nm，间隔15秒测读1次，持续5分钟，并置零
2． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热，避免光照。然后进行下列操作
三、 荧光测定
1． 准备2个1.5毫升离心管，并标记为对照样品管、抑制剂样品管
2． 分别加入XX微升缓冲液（Reagent A）
3． 加入XX微升补充液（Reagent D）到对照样品管
4． 加入50微升用户自备的抑制剂（注意：使用各种浓度梯度）到抑制剂样品管（注意：如果检测样品铜离子转运，可以省略这一操作）
5． 分别加入100微升待测样品（500微克蛋白或5 X 104细胞）
6． 分别加入XX微升标记液（Reagent B）
7． 放进37℃恒温培养箱孵育10分钟，避免光照
8． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
9． 分别小心抽去上清液，避免液体残留
10． 分别加入XX毫升缓冲液（Reagent A），混匀颗粒群
11． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
12． 分别小心抽去上清液，避免液体残留
13． 重复实验步骤11至13一次
14． 分别加入XX毫升缓冲液（Reagent A），混匀颗粒群
15． 转移到比色皿或酶标板
16． 分别加入XX微升离子液（Reagent C）
17． 小心枪头混匀（限定在3秒之内）
18． 即刻放进荧光分光光度仪（激发波长为506nm，散发波长530nm）：获得0分钟和设定系列时间至5分钟的相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）――
RFU降低，表明铜离子转运功能活性增强
19． 构建转运曲线：纵座标（Y）为相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（秒或分钟）
20． 构建抑制曲线（设定终点5分钟）：纵座标（Y）为相对荧光单位（RFU），横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
21． 构建百分率抑制曲线（设定5分钟）：纵座标（Y）为抑制百分率（％），横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
22． 根据上述曲线，计算IC50（50％抑制率所需的抑制剂浓度）
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 建议用户使用本公司的膜性囊泡（RSOV）制备试剂盒准备样品
4． 孵育时，避免光照
5． 建议加入离子液（Reagent C）后，即刻进行荧光检测分析
6． 用户根据实验情况，可以调整终点时间：2分钟、3分钟、5分钟
7． 用户可以在某个时间点，加入抑制剂，观察转运走势变化
8． 铜离子转运单位可以使用ΔRFU/分钟/毫克蛋白等
9． 可以使用铜螯合剂三乙烯四胺二盐酸盐（triethylenetetramine dihydrochloride；20微摩尔）作为抑制剂对照
10． 本公司提供系列离子膜通道转运功能（transport/uptake）分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS10164 铜离子膜通道转运功能（P型ATP酶）绿色荧光检测试剂盒 20次
G&VS10164A 缓冲液（Reagent A） 毫升
G&VS10164B 探针液（Reagent B） 毫升
G&VS10164C 离子液（Reagent C） 毫升
G&VS10164C 补充液（Reagent C） 毫升
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| G&VS10169.1 | 动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS10169.2 | 动物组织膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS10169.3 | 真菌/酵母膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS10169.4 | 细菌膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS10169.5 | 红细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS16021 | 植物膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒 | 20次 |
| G&VS10170 | IOV膜性囊泡高质纯化试剂盒 | 10次 |
| G&VS10164 | 铜离子膜通道转运功能（P型ATP酶）绿色荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10375 | 铜离子膜通道转运功能（CTR）绿色荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50245.1 | 动物细胞铜ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50245.2 | 动物组织铜ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50245.3 | 细菌铜ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50245.4 | 酵母铜ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50245.5 | 植物铜ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量检测试剂盒 | 20次 |
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