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发布时间：2026/8/26 18:44:24 阅读次数：25
钙离子膜通道内质网利罗丁受体（RyR）功能荧光检测试剂盒产品说明书
主要用途
钙离子膜通道内质网利罗丁受体（ryanodine receptor；RyR）功能荧光检测试剂是一种旨在使用选择性内质网型钙ATP酶和线粒体钙泵抑制剂的条件下，通过钙离子荧光探针，探测人为进入内质网内的钙离子，在ATP和4-氯-间甲酚激发下，产生荧光淬灭，来分析和观察内质网利罗丁受体转运功能的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物、人体、真菌/酵母、植物等内质网利罗丁受体活性的检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
利罗丁受体（ryanodine receptor；RyR）是细胞内两种钙离子释放通道中的一种，存在于各种肌肉和神经等可兴奋组织中，应对表面动作膜电位变化，即肌肉兴奋-收缩偶联机制（excitation-contraction coupling）。利罗丁受体是30S蛋白复合体，由4条多肽，每条有5000个氨基酸组成，分子量为560kD。其受到钙离子、ATP、钙调素等调节。利罗丁受体分成三型：I型骨骼肌型、II型心肌型、III型脑型。其间具有70%的序列同源。 利罗丁受体有两个主要结构域：羧基末端孔区域（carboxy-terminal pore）和膜外区域（extramembrane）。此外含有各种分子的结合位点，包括钙离子、核苷酸、钙调素（calmodulin）、FK506、ATP、以及蛋白激酶磷酸化位点等，使膜通道开放。利罗丁和普鲁卡因等抑制受体功能，而4-氯-间甲酚（4-Chloro-m-Cresol；4-CmC）和咖啡因激发受体功能。利罗丁受体异常将导致各种肌肉、心脏等先天性疾患，例如恶性高热（Malignant hyperthermia；MH）。Mag-Fluo--AM染料是一种钙离子低亲和性的荧光标记染料，特异性地由内质网捕获，可以检测内质网内的游离钙离子浓度的变化，进而分析利罗丁受体的作用模式，监测4-氯-间甲酚诱导的钙离子释放，来评价利罗丁受体的功能。其基本检测步骤是，首先引入荧光探针到内质网，其次膜通透处理后加入线粒体钙泵抑制剂FCCP和足量的钙离子到内质网钙池，然后同步加入ATP、内质网型钙ATP酶【sarcoplasmic reticulum（SR）/（ER）Ca++-ATPase；SERCA】抑制剂毒胡萝卜素（thapsigargin；TG）和4-氯-间甲酚，在荧光分光光度仪下（激发波长490nm，散发波长525nm）观察荧光峰值的变化。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 毫升
通透液（Reagent C） 微升
钙化液（Reagent D） 毫升
摄钙液（Reagent E） 微升
诱导液（Reagent F） 微升
释放液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；染色液（Reagent B）避免光照；有效保证6月
用户自备
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（G&VS12052）：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
微型台式离心机：用于样品操作
恒温水槽或培养箱：用于反应孵育
100微升比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析
实验步骤
一、 测定准备
1． 开启并设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为22℃）：激发波长为490nm，散发波长525nm，间隔30秒测读1次，或动态测读，并置零
2． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热，避免光照。然后进行下列操作
二、 荧光测定
（一） 间接法
1． 准备1个25cm2细胞培养瓶的待测细胞，铺满率达70％（1 X 106细胞数）
2． 小心抽去细胞培养液
3． 加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆盖细胞表面
4． 小心抽去清理液（Reagent A）
5． 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满细胞表面
6． 放进37℃培养箱孵育1分种
7． 轻轻抖动培养瓶，使细胞脱落
8． 加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
9． 移入到15毫升锥形离心管
10． 放进台式离心机离心5分钟，速度为600g（注意：悬浮细胞可以从这一步开始操作）
11． 小心抽去上清液
12． 加入xx微升染色液（Reagent B），混匀细胞颗粒群
13． 室温下孵育60分钟，避免光照
14． 放进台式离心机离心5分钟，速度为600g
15． 小心抽去上清液
16． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
17． 转移到1.5毫升离心管
18． 加入xx微升通透液（Reagent C）
19． 放进37℃培养箱，孵育4分钟（注意：这一步骤决定最大内质网钙池浓度读数；必要时可以调整孵育时间，既不能过长，导致细胞死亡，又不能过短，导致通透不足）
20． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
21． 小心抽去上清液
22． 加入xx毫升钙化液（Reagent D），混匀细胞颗粒群
23． 室温下孵育5分钟
24． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
25． 小心抽去上清液
26． 加入xx微升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
27． 分别移取100微升到5个100微升比色皿或黑色96孔板的5个孔，标记为背景、内质网钙、诱导钙释放、完全钙释放、待测抑制剂
28． 按下表分别加入
|
| 背景 | 内质网钙 | 诱导钙释放 | 完全钙释放 | 待测抑制剂 |
| 清理液（Reagent A） | xx微升 | —— | —— | —— | —— |
| 摄钙液（Reagent E） | —— | xx 微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
| 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪，动态测读3分钟，然后取出比色皿或黑色96孔板，分别加入下列试剂 | |||||
| 用户自备的 待测抑制剂 | —— | —— | —— | —— | xx微升 |
| 诱导液（Reagent F） | —— | —— | xx微升 | —— | xx微升 |
| 释放液（Reagent G） | —— | —— | —— | xx微升 | —— |
| 意义 | 基础读数 | 最大内质网 钙池浓度读数 | 4-CmC依赖性 诱导释放读数 | 最大释放读数 | RyR抑制剂 释放读数 |
29. 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪，动态测读2分钟
30. 获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
31. 分析结果
1) （内质网钙RFU—诱导钙释放RFU—背景RFU）：荧光差值越高，表明RyR转运功能活性越强
2) 【（内质网钙RFU—诱导钙释放RFU）÷（内质网钙RFU—完全钙释放RFU）】X 100%=诱导钙释放百分率：百分率越高，表明RyR转运功能活性越强
3) 构建转运曲线：纵座标（Y）为钙释放相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（秒）（注意：参见注意事项8）
4) 构建抑制曲线：纵座标（Y）为荧光差值RFU，横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
5) 根据上述曲线，计算IC50（50％抑制率所需的抑制剂浓度）
二、 直接法
1． 准备1个96孔细胞培养板中5个孔的待测细胞，铺满率达70％（5 X 104细胞数/孔），分别标记为背景、内质网钙、诱导钙释放、完全钙释放、待测抑制剂
2． 小心抽去细胞培养液
3． 小心加入xx微升 清理液（Reagent A）
4． 小心抽去清理液（Reagent A）
5． 小心加入xx微升染色液（Reagent B）
6． 室温下孵育60分钟，避免光照
7． 小心抽去染色液
8． 加入xx微升清理液（Reagent A）
9． 加入xx微升通透液（Reagent C）
10． 放进37℃培养箱，孵育4分钟（注意：这一步骤决定最大内质网钙池浓度读数；必要时可以调整孵育时间，既不能过长，导致细胞死亡，又不能过短，导致通透不足）
11． 小心抽去通透液
12． 加入xx微升钙化液（Reagent D）
13． 室温下孵育5分钟
14． 小心抽去钙化液
15． 加入xx微升清理液（Reagent A）
16． 按下表分别加入
|
| 背景 | 内质网钙 | 诱导钙释放 | 完全钙释放 | 待测抑制剂 |
| 清理液（Reagent A） | xx微升 | —— | —— | —— | —— |
| 摄钙液（Reagent E） | —— | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
| 即刻放进荧光酶标仪，动态测读3分钟，然后取出黑色96孔板，分别加入下列试剂 | |||||
| 用户自备的 待测抑制剂 | —— | —— | —— | —— | xx微升 |
| 诱导液（Reagent F） | —— | —— | xx微升 | —— | xx微升 |
| 释放液（Reagent G） | —— | —— | —— | xx微升 | —— |
| 意义 | 基础读数 | 最大内质网 钙池浓度读数 | 4-CmC依赖性 诱导释放读数 | 最大释放读数 | RyR抑制剂 释放读数 |
17． 即刻放进荧光酶标仪，动态测读2分钟
18． 获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
19． 分析结果
1) （内质网钙RFU—诱导钙释放RFU—背景RFU）：荧光差值越高，表明RyR转运功能活性越强
2) 【（内质网钙RFU—诱导钙释放RFU）÷（内质网钙RFU—完全钙释放RFU）】X 100%=诱导钙释放百分率：百分率越高，表明RyR转运功能活性越强
3) 构建转运曲线：纵座标（Y）为钙释放相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（秒）（注意：参见注意事项8）
4) 构建抑制曲线：纵座标（Y）为荧光差值RFU，横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）
5) 根据上述曲线，计算IC50（50％抑制率所需的抑制剂浓度）
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 孵育时，避免光照
4． 直接法，细胞换液时，避免使细胞脱落；如果细胞贴壁较松，建议使用间接法
5． 可以进行动态或定时荧光检测分析
6． 用户进行抑制剂筛选，建议使用浓度梯度
7． 可以使用RyR抑制剂 （Azumolene）作为抑制剂对照
8． 钙离子转运曲线参考图像如下：
∣基础∣ 钙摄入曲线 ∣钙释放
9． 本公司提供系列钙离子膜通道转运功能（transport/uptake）分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS10188 钙离子膜通道内质网利罗丁受体功能荧光检测试剂盒 20次
G&VS10188A 清理液（Reagent A） 毫升
G&VS10188B 染色液（Reagent B） 毫升
G&VS10188C 通透液（Reagent C） 毫升
G&VS10188C 钙化液（Reagent C） 毫升
G&VS10188A 摄钙液（Reagent A） 毫升
G&VS10188B 诱导液（Reagent B） 毫升
G&VS10188C 释放液（Reagent C） 毫升
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| G&VS10162.1.1 | 钙离子膜通道钙泵（F型ATP酶/线粒体、叶绿体）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10162.1.2 | 钙离子膜通道钙泵PMCA（P型ATP酶/质膜）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10162.1.3 | 钙离子膜通道钙泵SERCA（P型ATP酶/内质网）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10162.2.1 | 钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/线粒体）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10162.2.2 | 钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/质膜）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10162.2.3 | 钙离子膜通道钠钙交换体（NCX/内质网）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10188 | 钙离子膜通道内质网利罗丁受体（ryanodine receptor；RyR）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10189 | 钙离子膜通道内质网肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10257 | 钙离子膜通道二氢吡啶受体（DHPR）功能荧光检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10258 | 钙泵PMCA蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10259 | 钙泵SERCA蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10260 | 钙钠交换体NCX蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10261 | RyR受体蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10262 | IP3R受体蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS10263 | DHPR受体蛋白表达检测试剂盒 | 20次 |
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