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蛋白巯基化（S-thiolation）高效液相色谱（HPLC）分析试剂盒产品说明书

发布时间：2026/8/31 10:55:28 阅读次数：27

蛋白巯基化（S-thiolation）高效液相色谱（HPLC）分析试剂盒产品说明书

主要用途

蛋白巯基化（S-thiolation）高效液相色谱（HPLC）分析试剂是一种旨在通过稳定或还原预处理和衍生化反应，进而在高效液相色谱仪和可见光谱下（412nm波长）检测分析，分离出巯基化蛋白波峰，以定量测定样品中蛋白质巯基化水平的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于人体、动物等细胞、组织、血液（血浆、血清）等样品中蛋白巯基化的检测。可用于氧化应激反应等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

蛋白巯基化（S-thiolation）是转译后蛋白质修饰（modification）的一种方法，通过部分氧化的蛋白质巯基（sulfhydryls）与硫醇（thiols），例如半胱氨酸或谷胱苷肽，的反应，或者通过谷胱苷肽的二硫键氧化形式中二硫化物-硫醇的置换反应，从而实现修饰，调节蛋白质功能，其间无需酶的作用，但受到细胞内氧化还原状态的调度。蛋白巯基化是巯基氧化产生许多低分子量硫醇（low molecular weight thiols），其作用于抗氧化机制，防止半胱氨酸残基不可逆氧化成高度氧化状态。在防御氧化应激条件下，蛋白巯基化通过直接还原实现可逆反应。已经确认的应对氧化应激产生蛋白质巯基化的蛋白，包括碳酸酐酶（carbonic anhydrase III）、肌动蛋白（actin）、肌酸激酶（creatine kinase）、糖原磷酸化酶b 、（glycogen phosphorylase b）、苷油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）等。蛋白巯基化可以作为机体氧化应激反应或氧化损伤程度的生物指数：血浆蛋白质巯基化指数（protein thiolation index）。谷胱苷肽是主要硫醇分子种类之一。蛋白巯基化也可视作为谷胱苷肽化（glutathionylation）。Ellman引入5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]，与巯基的特异性结合反应，产生混合巯基和黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），用于分析蛋白质巯基化水平。基于DTNB的特性，通过样品N-乙基马来酰亚胺（N-Ethylmaleimide；NEM）或二硫苏糖醇（Dithiothreitol；DTT）预处理后，与DTNB反应，进而在高效液相色谱仪和光度仪下（412nm波长）检测分析，分离出巯基化蛋白，以定量分析蛋白巯基化的水平。

产品内容

裂解液（Reagent A）毫升

稳定液（Reagent B）毫升

还原液（Reagent C）毫升

标记液（Reagent D）毫升

流相液A（Reagent E）毫升

流相液B（Reagent F）毫升

标准液（Reagent G）微升

产品说明书 1份

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、还原液（Reagent C）、标记液（Reagent D）和标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，标准液（Reagent G）避免光照；流相液B（Reagent F）具有挥发性，注意密闭瓶盖；有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

超声仪：用于裂解组织细胞

（微型）台式离心机：用于样品处理

恒温水槽：用于反应孵育

高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

一、 样品准备

1） 血浆样品准备

1．准备好EDTA抗凝管

2．抽取1毫升血液，置于抗凝管里

3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4．小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）

5．（选择步骤）即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

6．分别移取250微升血浆到2个1.5毫升离心管，并标记为稳定处理管和还原处理管

7．加入xx微升稳定液（Reagent B）到稳定处理管，混匀

8．加入xx微升还原液（Reagent C）到还原处理管，混匀

9．放进37℃恒温水槽孵育20分钟

10．置于冰槽里

11．即刻进行后续高效液相色谱分析

2） 血清样品准备

1．准备好不含抗凝剂的储存管

2．抽取1毫升血液，置于储存管里

3．室温下，静置30分钟，直至血液凝结

4．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）

5．小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）

6．分别移取250微升血清到2个1.5毫升离心管，并标记为稳定处理管和还原处理管

7．加入xx微升稳定液（Reagent B）到稳定处理管，混匀

8．加入xx微升还原液（Reagent C）到还原处理管，混匀

9．放进37℃恒温水槽孵育20分钟

10．置于冰槽里

11．即刻进行后续高效液相色谱分析

3） 细胞样品准备

1．准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2．小心加入xx毫升用户自备的磷酸缓冲液，覆盖生长表面

3．小心抽去磷酸缓冲液

4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5．加入3毫升用户自备的磷酸缓冲液，混匀细胞

6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8．小心抽去上清液

9．加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀

10．转移到预冷的1.5毫升离心管

11．超声仪处理：100瓦功率，3秒一次，冰上间隙1分钟，重复3至5次

12．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13．分别移取250微升上清液到2个1.5毫升离心管，并标记为稳定处理管和还原处理管

14．加入xx微升稳定液（Reagent B）到稳定处理管，混匀

15．加入xx微升还原液（Reagent C）到还原处理管，混匀

16．放进37℃恒温水槽孵育20分钟

17．置于冰槽里

18．即刻进行后续高效液相色谱分析

4） 组织样品准备

1．手术取出动物组织，并秤重以确定20至100毫克组织重量

2．移入到一个液氮冻存管

3．即刻放进液氮罐过夜

4．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

5．放进一个1.5毫升离心管

6．加入预冷的xx微升裂解液（Reagent A）

7．强力涡旋震荡30秒，充分混匀

8．超声仪处理：100瓦功率，3秒一次，冰上间隙1分钟，重复3至5次

9．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g

10．分别移取250微升上清液到2个1.5毫升离心管，并标记为稳定处理管和还原处理管

11．加入xx微升稳定液（Reagent B）到稳定处理管，混匀

12．加入xx微升还原液（Reagent C）到还原处理管，混匀

13．放进37℃恒温水槽孵育20分钟

14．置于冰槽里

15．即刻进行后续高效液相色谱分析

二、 测定准备

1．开启仪器预热15分钟

2．根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数

参数	推荐	补充说明
色谱柱	长度：25cm 直径：4.6mm	Waters仪器或 Agilent仪器
固定相	ODS
流动相	流相液A（Reagent E）和流相液B（Reagent F）
流速	1毫升/分钟
注射容量	50微升	10微升至100微升
检测	可见光
波长	412nm
柱温	30℃
峰值时间（retention）	3.7分钟	巯基化蛋白
运行时间	30分钟	参考

3．运行程序

运行时段	程序	时间
开机后预运行	100% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）	总10分钟
检测运行时段	100% 流相液A（Reagent E）至0% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）至100% 流相液B（Reagent F）	0至15分钟
关机前运行	0% 流相液A（Reagent E）至100% 流相液A（Reagent E） 100%流相液B（Reagent F）至100% 流相液B（Reagent F）	总3分钟

4．使用流相液A（Reagent E）运行1次（30毫升），以达到色谱柱均衡和温度稳定

三、 标准样品配制

1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2．分别加入xx微升流相液A（Reagent E）到1至5号管

3．移取xx微升标准液（Reagent G）到1号管，混匀

4．小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent G）到2号管，混匀

5．小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent G）到3号管，混匀

6．小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent G）到4号管，混匀

7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号	流相液A（Reagent E）	标准液（Reagent G）	标准谷胱苷肽浓度
1	xx微升	xx微升	xx微摩尔/升
2	xx微升	xx微升1号管	xx微摩尔/升
3	xx微升	xx微升2号管	xx微摩尔/升
4	xx微升	xx微升3号管	xx微摩尔/升
5	xx微升	0	0

四、色谱分析

1．分别移取xx微升上述配制的标准液（Reagent G）或待测样品（稳定处理和还原处理）到1.5毫升离心管里

2．分别加入xx微升标记液（Reagent D），混匀

3．室温下孵育15分钟

4．置于冰槽里，准备注射

5．每次（每个样品）注射100微升

6．每次（每个样品）运行30分钟

7．获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录

8．全部运行完成，使用适量的流相液A（Reagent E）清洗色谱柱

五、计算蛋白质巯基化水平

1．方法一：通过仪器中的软件进行测算

2．方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准谷胱苷肽浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应谷胱苷肽浓度（微摩尔/升）

3．方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）

样本谷胱苷肽浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准谷胱苷肽浓度（微摩尔/升）】÷对应标准谷胱苷肽浓度的波峰面积

蛋白质巯基化水平（谷胱苷肽微摩尔/升）=稳定处理管样品硝基化（谷胱苷肽）浓度（微摩尔/升）—还原处理管样品硝基化（谷胱苷肽）浓度

转换：蛋白质巯基化水平（谷胱苷肽纳摩尔/毫升）÷样品蛋白浓度（毫克/毫升）=蛋白质巯基化水平（谷胱苷肽纳摩尔/毫克）

注意事项

1．本产品为20次操作

2．本产品可以用于各种特定蛋白的巯基化检测

3．用户可以使用过氧化氢、甲萘醌、二酰胺、三丁基过氧化氢等诱导蛋白质硫基化

4．本产品检测范围是1至100微摩尔/升

5．操作时，须戴手套

6． 流相液B（Reagent F）具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜

7．色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等

8．用户可以使用已知浓度的标准液（Reagent G）作为内参标准加入到样品中，检测回收率（recovery）

9．蛋白巯基化的HPLC参考图谱如下

10．巯基化蛋白衍生物的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（Reagent G）实际出峰为准

11．本公司提供系列蛋白巯基化检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

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订购信息

单组份订购信息

编号名称规格

G&VS10368.1 蛋白巯基化高效液相色谱（HPLC）分析试剂盒 20次

G&VS10368.1A 裂解液（Reagent A）毫升

G&VS10368.1B 稳定液（Reagent B）毫升

G&VS10368.1C 还原液（Reagent C）毫升

G&VS10368.1D 标记液（Reagent D）毫升

G&VS10368.1E 流相液A（Reagent E）毫升

G&VS10368.1F 流相液B（Reagent F）毫升

G&VS10368.1G 标准液（Reagent G）毫升

试剂盒订购信息

产品编号	名称	规格
G&VS10368.1	蛋白巯基化（S-thiolation）高效液相色谱（HPLC）分析试剂盒	20次
G&VS10368.2	蛋白巯基化（S-thiolation）同位素法分析试剂盒	20次