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纯化线粒体ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2026/9/3 10:50:28 阅读次数：3

纯化线粒体ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

纯化线粒体ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP或AMP波峰，以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体纯化线粒体样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。

产品内容

清理液（Reagent A） 100毫升

裂解液（Reagent B） 100毫升

酸性液（Reagent C） 5毫升

中和液（Reagent D） 1毫升

流相液A（Reagent E） 500毫升

流相液B（Reagent F） 500毫升

标准液（Reagent G） 500微升

产品说明书 1份

保存方式

保存标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（G&VS12028）或PBS缓冲溶液（G&VS12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（G&VS12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（G&VS12052）：用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

一、 样品准备

1） 组织线粒体制备

1．手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）

2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管

3．（选择步骤）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4．即刻用刀片切碎组织

5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6．加入5毫升预冷的裂解液（Reagent B）

7．涡旋震荡5秒，充分混匀

8．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

9．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项8）

10．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

11．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

12．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

13．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

14．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒

15．加入200微升预冷的酸性液（Reagent C）

16．涡旋震荡1分钟

17．转移到1.5毫升离心管

18．放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g

19．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

20．加入31微升中和液（Reagent D），充分混匀

21．置于冰槽里静置30分钟

22．即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）

23．放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测

2）细胞线粒体制备

1．准备1瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（1 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面

2．加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去

3．重复实验步骤2一次

4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

5．置入37℃培养箱3分种

6．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，

7．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

8．移入一个50毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从此步骤开始）

9．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

10．小心抽去上清液

11．加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞

12．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

13．小心抽去上清液

14．加入5毫升预冷的裂解液（Reagent B）

15．涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

16．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

17．在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下）

18．将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

19．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

21．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g

22．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒

24．加入200微升预冷的酸性液（Reagent C）

25．涡旋震荡1分钟

26．转移到1.5毫升离心管

27．放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟，速度为6000g

28．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

29．加入31微升中和液（Reagent D），充分混匀

30．置于冰槽里静置30分钟

31．即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管（注意：避免移取沉淀颗粒）

23．放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测

二、测定准备

1．开启仪器预热15分钟

2．根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数

参数	推荐	补充说明
色谱柱	长度：25cm 直径：4.6mm	Waters仪器或 Agilent仪器
固定相	ODS
流动相	流相液A（Reagent E）和流相液B（Reagent F）	参见运行程序
流速	1.3毫升/分钟
注射容量	50微升	10微升至100微升
检测	紫外
波长	254nm
柱温	25℃
出峰时间（retention）	5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)	参考
运行时间	15分钟	参考

3．运行程序

运行时段	程序	时间
开机后预运行	100% 流相液A（Reagent E）	总10分钟
检测运行时段	100% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）	0至9分钟
检测运行时段	100% 流相液A（Reagent E）至 75% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）至25%流相液B（Reagent F）	9至15分钟
关机前运行	100% 流相液A（Reagent E） 0%流相液B（Reagent F）	总10分钟

三、 标准样品配制

1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2．分别加入100微升流相液A（Reagent E）到1至5号管

3．移取100微升标准液（Reagent G）到1号管，混匀

4．小心移取100微升1号管稀释的标准液（Reagent G）到2号管，混匀

5．小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent G）到3号管，混匀

6．小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent G）到4号管，混匀

7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号	流相液A（Reagent E）	标准液（Reagent G）	标准ATP/ADP/AMP浓度
1	100微升	100微升	100微摩尔/升
2	100微升	100微升1号管	50微摩尔/升
3	100微升	100微升2号管	25微摩尔/升
4	100微升	100微升3号管	12.5微摩尔/升
5	100微升	0	0

四、色谱分析

1．将上述配制的标准液（Reagent G）和待测样品放进冰槽里等待

2．每次（每个样品）注射50微升

3．按照检测运行程序每次（每个样品）运行15分钟

4．获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录

五、计算样本ATP/ADP/AMP浓度

1．方法一：通过仪器中的软件进行测算

2．方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得样品对应ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）

3．方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）

样本ATP/ADP/AMP浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准ATP/ADP/AMP浓度】÷对应标准ATP/ADP/AMP浓度的波峰面积

注意事项

1．本产品为25次操作，包括标准液

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，标准液测定只需1次

4．试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜

5． 酸性液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全

6．建议使用流相液A（Reagent E）作为阴性对照或作为基准线

7．色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等

8．用户可以使用已知浓度的标准液（Reagent G）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）

9．腺嘌呤核苷酸的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（Reagent G）实际出峰为准

10．用户可以根据要求，计算实际浓度为：纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等

11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12．腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下：

13．本公司提供系列腺嘌呤核苷酸检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

单组份订购信息

编号名称规格

G&VS10481.4 纯化线粒体ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒 20次

G&VS10481.4A 清理液（Reagent A） 100毫升

G&VS10481.4B 裂解液（Reagent B） 100毫升

G&VS10481.4C 酸性液（Reagent C） 10毫升

G&VS10481.4D 中和液（Reagent D） 5毫升

G&VS10481.4E 流相液A（Reagent E） 500毫升

G&VS10481.4F 流相液B（Reagent F） 500毫升

G&VS10481.4G 标准液（Reagent G） 1毫升

试剂盒订购信息

产品编号	名称	规格
G&VS10481.1	通用型ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.2	细胞ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.3	组织ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.4	纯化线粒体ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.5	细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.6	真菌/酵母ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次
G&VS10481.7	植物ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法定量检测试剂盒	20次