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发布时间：2024/6/17 14:39:31 阅读次数：152
主要用途
细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物硬脂酰辅酶A诱导还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所还原的细胞色素b5的再氧化后吸光峰值的降低，即采用光谱法定量测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种原代细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、纯化微粒体样品硬脂酰辅酶A去饱和酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl CoA desaturase；SCD；EC1.14.19.1），又称为Δ9去饱和酶（delta-9 desaturase），是四类去饱和酶（Δ9、Δ6、Δ5、Δ4）之一，一种内质网整合性膜蛋白，参与内源性或外源性脂肪酸代谢的关键酶之一。通过限速催化氧化反应，在9号位上引入双键，由饱和脂肪酸底物，例如棕榈酸辅酶A（palmitoyl CoA）和硬脂酸辅酶A（stearoyl CoA），生物合成不饱和单脂肪酸，例如棕榈油酸辅酶A（palmitoleoyl CoA）和油酸辅酶A（oleoyl CoA），后者成为甘油三脂、胆固醇酯、磷脂、腊酯等脂类生物合成的底物，调节信号传导和细胞分化。哺乳动物的硬脂酰辅酶A去饱和酶分成5种亚酶：其中小鼠4种（SCD1至SCD4）、大鼠2种（SCD1、SCD2）、人体2种（SCD1和SCD5）已经克隆证实。人体SCD1存在于大多数组织，而SCD5主要分布在脑组织和胰腺组织中。人体SCD1的活性与血清甘油三脂、极低密度脂蛋白（VLDL）水平直接相关，同时影响血清高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇水平，以及胆固醇转运、不饱和单脂肪酸的分泌和产生、细胞分化、胰岛素敏感性等。硬脂酰辅酶A去饱和酶成为药物靶标，用于治疗心血管疾病和肥胖症等。基于氧化型细胞色素b5（oxidized cytochrome b5），在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）的存在下，受到内源性细胞色素b5还原酶的催化，转化为还原型细胞色素b5（reduced cytochrome b5），进而底物硬脂酰辅酶A，在硬脂酰辅酶A去饱和酶的催化下，转化为油酸辅酶A，同时还原型细胞色素b5再次被氧化（reoxidation）为氧化型细胞色素b5，在分光光度仪下，出现吸光值的变化（424nm 波长），来定量测定硬脂酰辅酶A去饱和酶的活性。其反应系统为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 微升
底物液（Reagent E） 微升
阴性液（Reagent F） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在-20℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
4℃（微型）台式离心机：用于样品处理
4℃超速离心机：用于样品处理
恒温水槽或培养箱：用于样品反应孵育
比色皿或96孔板：用于光谱分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光谱分析
实验步骤
一、 样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 涡旋震荡5秒，充分混匀
12． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
13． 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）
14． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
15． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为10000g
16． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为总蛋白样品
17． 放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
18． 小心抽去上清液
19． 加入xx微升裂解液（Reagent B），混匀颗粒群——此为微粒体样品
20． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
21． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测读准备
1． 准备好待测样品，置于冰槽里融化
2． 设定好分光光度仪或酶标仪：温度25℃，波长424nm，间隔30秒，测读7次（共3分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 样品背景对照测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的200微升比色皿
2． 加入20微升待测样品（注意：建议总量200微克微粒体蛋白）
3． 加入xx微升反应液（Reagent D）
4． 在25℃温度下孵育5分钟
5． 加入xx微升阴性液（Reagent F）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景空对照（注意：参见注意事项10）
四、 样品活性测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的200微升比色皿
2． 加入20微升待测样品（注意：建议总量200微克微粒体蛋白）
3． 加入xx微升反应液（Reagent D）
4． 在25℃温度下孵育5分钟
5． 加入xx微升底物液（Reagent E）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数（注意：参见注意事项10）
五、 计算样品活性
六、酶标板测定
1． 在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和待测样品活性
2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
3． 分别加入20微升待测样品（注意：建议总量200微克微粒体蛋白）到所有孔里
4． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）到所有孔里
5． 轻轻摇动96孔酶标板
6． 在25℃温度下孵育5分钟
7． 加入xx微升阴性液（Reagent F）到样品背景对照孔里
8． 加入xx微升底物液（Reagent E）到待测样品活性孔里
9． 轻轻摇动酶标板（限定在3秒之内）
10． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数（注意：参见注意事项10）
11． 活性计算：
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 样品忌用DTT和巯基乙醇等处理
4． 样品背景和样品活性需平行检测
5． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
6． 反应物混合后3秒内进行光谱测定
7． 光谱测定后，比色皿须清洗彻底
8． 通常背景空对照的吸光读数会呈现降低，表明样品中含有细胞色素b5还原酶的干扰以及细胞色素b5的自发氧化
9． 样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数理论上一致
10． 样本测定3分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
11． 建议选择样品读数开始下降后的1分钟OD值作为活性读数（initial rate），同时选择平行时间的背景OD值作为背景对照读数
12． 如果酶活性过低，可以延长反应时间
13． 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为100微克/10微升 （本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1）
14． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
15． 硬脂酰辅酶A去饱和酶活性单位浓度定义：在25℃室温下，pH 8.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）再氧化1微摩尔的细胞色素b5
16． 本公司提供系列酶学检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息
单组分订购信息
编号 名称 规格
G&VS50610.1 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶活性高效液相色谱比色法定量检测试剂盒 20次
G&VS50610.1A 清理液（Reagent A） 毫升
G&VS50610.1B 裂解液（Reagent B） 毫升
G&VS50610.1C 缓冲液（Reagent C） 毫升
G&VS50610.1D 反应液（Reagent D） 毫升
G&VS50610.1E 底物液（Reagent E） 毫升
G&VS50610.1F 阴性液（Reagent F） 毫升
试剂盒订购信息
| 产品编号 | 名称 | 规格 |
| G&VS50492.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性 高效液相色谱（HPLC）比色法定量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50492.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性 高效液相色谱（HPLC）比色法定量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50493.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性 薄层色谱（TLC）同位素法定量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50493.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性 薄层色谱（TLC）同位素法定量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50610.1 | 细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DESATURASE）活性光谱法定量检测试剂盒 | 20次 |
| G&VS50610.2 | 组织硬脂酰辅酶A去饱和酶（STEAROYL COA DEHYDROGENASE）活性 光谱法定量检测试剂盒 | 20次 |
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