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原位细胞凋亡检测试剂盒POD说明书

发布时间：2024/6/18 13:47:09 阅读次数：84

产品及特点：
细胞凋亡在许多生理过程中是至关重要的。目前已经描述了几种鉴定细胞凋亡的方法。核内解离被认为是凋亡的关键生化事件，导致双链，低分子量 DNA 片段以及高分子量 DNA 中的单链断裂。可以通过在酶反应中用修饰的核苷酸标记游离的 3'-OH 末端来鉴定那些 DNA 链断裂。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以催化 DIG-dUTP 释放 3'-OH DNA 末端。 DIG-dUTP 首先与生物素偶联的抗地高辛抗体反应，后者与链霉抗生物素蛋白（SABC）结合。结合 DAB ，在显微镜下分析凋亡细胞染色黄色。

规格及成分
本产品使用大纸盒包装

成分                               编号                         规格                                  包装
标记缓冲液                         11-230510a         5mL               10mL               棕色瓶
末端转移酶，20×                      11-230510b        100μL               0.5mL           红盖管
地高辛- 11-dUTP 溶液，20×     11-230510c        100μL               0.5mL            蓝盖管
封闭剂                                      11-230510d           20mL               30mL            棕色瓶
生物素偶联抗地高辛抗体           11-230510e         100μL               0.5mL            绿盖管
SABC ， 100×                         11-230510f           100μL               0.5mL           红盖管
蛋白酶 K ，200×                        11-230510g           250μL               0.5mL          白盖管
抗体稀释液                            11-230510h            20mL               30mL             本色瓶
阳性对照样品                             11-230510i             2 样                                      塑料袋
使用手册                         11-230510sc         1 份                                        无

运输及保存
低温运输及保存，有效期一年。

自备试剂
中性树胶、 NaCl、Tris 、乙酸、 3 ％H 2 O 2、双蒸水、二甲苯等

使用方法
1.样品制备:
a. 对于细胞涂片：在室温下用 4％多聚甲醛固定 30-60 分钟，并用 PBS冲洗两次，每次 2-5 分钟。
b. 对于冷冻切片：在室温下用 4％多聚甲醛固定 30-60 分钟，并用 PBS冲洗两次，每次 2-5 分钟。
c. 对于石蜡切片：根据标准方案进行脱水和脱水组织切片，并用 PBS 冲洗两次，每次 2 分钟。
2.加入 50μL 新鲜制备的 3％ H 2 O 2 ，并在室温下孵育 10 分钟。
3.用双蒸水洗涤三次，每次 2 分钟。
4.用 0.01M TBS 将蛋白酶 K ，200×   to    1× 工作液。
5.   (0.01M TBS 的制备：加入 8.5g NaCl, 1.2g Tris and 0.45-0.5 mL乙酸至 1L 双蒸水中，溶解，混匀。)
6.   加入 20- 100 μL 蛋白酶 K 工作液至样品中 (仅限石蜡切片，细胞和冷冻切片不需要蛋白 K 消化），并在 37℃下消化 5- 15 分钟。然后用 0.01M TBS 冲洗 3 次，每次 2 分钟。反应混合物的制备：加入 1 μL 末端转移酶， 20× and 1 μL 地高辛- 11-dUTP 溶液，20×至 18 μL 标记缓冲液中，混匀。
7.   将反应混合物加入到样品中，在二氧化碳培养箱中， 37℃ , 孵育 2 小时。
8.   用 0.01M 的 TBS 洗涤三次，每次 2 分钟。 Rinse with 0.01M TBS three times, 2 minutes each time.
9.   加入 50 封闭剂，室温孵育 30 分钟，丢弃阻断试剂，在此步骤无需洗涤样品。
10. 用抗体稀释液按照 1:100 的比例稀释生物素偶联抗地高辛抗体, 混匀，加入 50μL 至样品中。
11. 在二氧化碳培养箱中， 37℃ , 孵育 2 小时
12. 用 0.01M TBS 洗涤 3 次,每次两分钟。
13. 用抗体稀释液按照 1:100 的比例稀释 SABC ，混匀，加入 50 μL 至样品中。
14. 在二氧化碳培养箱中， 37℃ , 孵育 2 小时
15. 用 0.01M TBS 洗涤 3 次,每次五分钟。
16. Dilute 900 μL DAB Buffer (50 μL DAB Substrate (20 X) and 50 μLDAB Chromogen (20 X) to 850μL ddH2O and mix well.
17. 在每个载玻片上加入 50μLDAB 混合物，避光，并在室温下孵育 5- 10 分钟。
18. 用双蒸水洗涤载玻片。
19. 用苏木素染液染色 5- 10 分钟.
20. 用双蒸水冲洗两次，每次 5 分钟。
21. 75%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
22. 85%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
23. 95%乙醇中室温浸泡 5 分钟；
24. 二甲苯室温浸泡 15 分钟，
25. 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片

关联产品：白细胞 DNA 提取试剂盒（过柱法）