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随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒

发布时间：2024/6/19 8:39:41 阅读次数：112

CAT#:JW-220315-5
低温运输、-20℃保存

产品及特点
本产品是基于 Feinberg 和 Vogelstein 发明的随机引物标记法而开发出来的即用型 DNA 探针标记试剂盒，标记过程由双链 DNA 热变性、随机引物与单链 DNA 结合、在 Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探针并掺入标记的核苷酸三步组成，
可用下面的示意图表示：

本产品对 Feinberg 和 Vogelstein 经典方法进行了改良，具有下列特点：
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已标记 DNA 探针不会被酶降解，探针产量更高。
3.快速，最快 1 小时即可完成标记反应。
4.所需模版 DNA 量少，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的，但长度必须在 100 bp 以上。
5.得到的探针长度一般在 200-400 nt 之间（如果模板长度在 1kb 以上），可以用于Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
6.本产品足够 5 次 DNA 模板的生物素标记实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份                                              编号      规格           包装
2×随机引物生物素标记反应液      220315a      50 uL   0.5mL 绿盖管
Klenow exo-聚合酶，2U/uL         220315e      5 uL   0.5mL 红盖管
超纯水                                           100935          1 mL   1.5mL 蓝盖管
使用手册                                        220315sc    1 份             无

运输及保存   低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂   0.5M EDTA（ pH8.0），需要自备标记的核苷酸。

使用方法
1.在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分                                             用量
模板 DNA                                 50- 150 ng
2×随机引物生物素标记反应液   10 uL
超纯水                                      补水到 19 uL
注意：非同位素标记基团（如生物素和地高辛）疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化塑料离心管。模板 DNA 并非越多越好，否则没有标记的模板DNA 在杂交时会竞争性地抑制标记 DNA 跟靶分子的杂交，反而降低杂交信号强度。
2.沸水浴 10 分钟，或在 PCR 仪上 100℃加热 10 分钟彻底变性模板 DNA，结束后需
要立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板 DNA 单链又会杂交形成双链。
3.离心数秒使所有液体集中在管底，再加入 1 uL Klenow exo DNA 聚合酶。
4.轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，离心数秒使所有液体集中在管底。
5.37℃保温 1-20 小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，杂交需要一定量的探针，同时在杂交时探针模板比越高，没有标记的模板 DNA 对杂交的竞争性抑制越低。
用户需要在这两者之间进行折衷选择。具体可以参考下表：
模版 DNA 用量（ng）     1 小时后探针合成量 /探针模板比      20 小时后探针合成量 /探针模板比
10                                                    80ng/8                                                900ng/90
30                                                   150ng/5                                               1350ng/45
100                                                 350ng/3.5                                            1650ng/ 16.5
300                                                 750ng/2.5                                    2200ng/7.3
1000                                               1300ng/ 1.3                                     2600ng/2.6
3000                                               1600ng/0.53                                  600ng/0.87
6.反应结束后加热 100℃ 5 分钟使 DNA 聚合酶变性，同时使 DNA 探针变性成单链。变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，不要用酚抽提法纯化非同位素标记的 DNA 探针，因为这些标记分子（如生物素或地高辛等）疏水性强，能使标记的 DNA 进入疏水的有机相而丢失。只能选择乙醇直接沉淀或 Sephad ex G50 过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的同位素标记探针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。

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