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miRNA 染料法 qRT-PCR 试剂盒（polyA 加尾法）

发布时间：2024/6/19 9:31:23 阅读次数：95

CAT#:JW-931042-25
低温运输，-20℃保存

产品及特点
本试剂盒采用E.coli polyA聚合酶对miRNA加尾，然后用特异引物进行逆转录，最后用荧光定量PCR试剂盒进行定量检测，其原理示意图如下：

本产品具有下列特点：
1.两步法（加尾-逆转录、染料法 qPCR），一步完成加尾-逆转录，然后检测多个 miRNA 靶分子。一次加尾-逆转录反应得到的 cDNA 可以做上百次 PCR。
2.直接用总 RNA 为模板，不需要专门纯化 miRNA ，简单快捷。
3.检测灵敏度可以达到几百个拷贝/反应。
4.能区分有 2-3 个碱基不同的 miRNA。
5.既可以定性，也可以定量。定量时线性范围至少有 5 个数量级，但需要自备标准品。
6.既可以用总 RNA 为模板，也可以用总 miRNA 为模板。
7.用户需要自备 miRNA 专一性的一条 PCR 上游引物。
8.本产品足够 25 次 20uL 体系的加尾和逆转录反应，100 次 20uL 体系的染料法qPCR。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分   本产品使用十孔盒包装
成分                  编号          规格       包装材料
加尾和逆转录 Mix（含 dNTP 和 ATP）       931042a       150 μL       0.5mL 绿盖管
miRNA-polyA RT 引物             931042b       干粉       0.5mL 本色管
E.coli polyA 聚合酶和M-MLV逆转录酶混合液   931042c       40 μL       0.5mL 红盖管
miRNA PCR 通用下游引物                                931042d       干粉       0.5mL 黄色管
2×SYBR PCR MasterMix          990408       1 mL       0.5mL 棕色管
超纯水                      980403       1 mL       2.0mL 蓝盖管
使用手册                      931042sc       1 份       无
注意：上表的两个引物用前需要加入 30uL 的超纯水充分溶解混匀后才可使用。

运输及保存   低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂   总 RNA、miRNA 专一性上游引物（5pmol/μL in 水中）

使用方法
一、设计、合成和分析自备的 miRNA 专一性上游引物
1.本试剂盒需要用户自行设计一条 miRNA 靶分子专一性的上游引物跟试剂盒提供的通用引物共同使用，用超纯水稀释到 5pmol/μL 待用。
2.miRNA 专一性上游引物的 Tm 值决定后续 PCR 的复性温度，非常重要，故必须准确。可以通过网上的在线分析软件（如oligoanalyzer）计算 Tm，但最好实验测定，做法是将 100pmol miRNA 专一性上游引物和等量的互补引物（不是下游引物）在 20μL 的本试剂盒提供的 2×SYBR PCR MasterMix 反应体系中混合（参考第 9 步，只是不加模板，其他成分都加），直接进行溶解曲线分析，测出在本试剂盒提供的反应体系中的 Tm 值。当软件计算的 Tm值和实验测试的 Tm 值有差异时，以后者为准。
3.miRNA 专一性上游引物最好在 3 端比 miRNA 短几个碱基。
4.可以选择一个所研究物种的 5.8S rRNA 作为内参，设计一条 5.8S rRNA 专一性的引物，同时做平行实验。

二、准备总 RNA
5.用自选方法和试剂纯化总 RNA，测定其浓度，最后用超纯水将其稀释到 100ng/μL 。总 RNA 样品中残留的 DNA 污染由于并没有下游通用引物（miRNA-polyA RT 引物）的结合位点，所以一般不会干扰基于本方法的miRNA PCR 检测。

三、加尾及逆转录反应
6.按下表设置 RNA 加尾和逆转录反应，以 1 个样品为例：

加入组分                                                                 体积
自备的总 RNA ，100ng/μL               2.0 μL
加尾和逆转录 Buffer（含 dNTP 和 ATP）           5.5 μL
miRNA-polyA RT 引物                  1.0 μL
E.coli polyA 聚合酶和M-MLV 逆转录酶混合液       1.5 μL
合计                         10 μL
7.37℃保温 1 小时。
8.加入 190μL 超纯水使得总体积为 200μL（稀释 20 倍），此样品将作为 cDNA模板用于 PCR 。未用完的 cDNA 20 倍稀释样品可以放-20℃至少两年以上。

二、染料法 qPCR
9.按下表设置染料法 qPCR 反应，最好每个反应设置 3 个重复：

加入组分              体积
2×SYBR PCR MasterMix       10 μL
自备 Forward Primer ，5pmol/μL    1 μL
miRNA PCR 通用下游引物，5pmol/μL       1 μL
第 8 步所得 miRNA cDNA 20 倍稀释液       1 μL
超纯水              7 μL
10. 建议反应程序设置如下：

循环                       温度                           时间

PCR45次      95℃                         15 秒
                      （miRNA 特异引物 Tm-5） ℃      15 秒
      72℃         20 秒
溶解曲线分析       根据 PCR 仪要求设定
11. 分析溶解曲线分析所得 Tm（在 70-80℃之间一般表示扩增是特异的），分析Ct 值，分析标准曲线的斜率和 R2（如果用阳性对照做了标准曲线反应的话）。

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