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植物细胞色素P450亚酶51G1（Obtusifolio 14α-demethylase）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2026/11/4 11:42:33 阅读次数：3

植物细胞色素P450亚酶51G1（Obtusifolio 14α-demethylase）活性高效液相

色谱法（HPLC）定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

植物细胞色素P450亚酶51G1（Obtusifolio 14α-demethylase）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂是一种旨在通过底物钝叶醇，受到CYP51G1的去甲基化作用后，经过皂化处理和有机溶剂萃取，进而在高效液相色谱仪和紫外光谱下（248nm波长）检测分析其底物耗损程度，以定量测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物细胞或组织裂解萃取液样品、纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶CYP51G1的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞色素P450酶是细胞微粒体复合功能单加氧化酶系统的总称，作用在于生物体内外源化合物（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation）。P450亚酶CYP51G1，是亚酶51家族中的植物类亚酶（其中动物为51A；原生动物为51B；细菌为51F；真菌为ERGII等）。P450亚酶CYP51在真菌和动物中高度保留，催化固醇类前体的14-α-去甲基化反应，包括动物或酵母的羊毛甾醇（Lanosterol）、二氢羊毛甾醇（dihydrolanosterol）、丝状真菌的齿孔醇（eburicol）、植物的纯叶醇（obtusifolio）等。P450亚酶CYP51G1，又称为纯叶醇1,4α去甲基化酶（obtusifolio 14 -α-demethylase），是植物固醇生物合成通路的启动反应的重要酶，与植物生长发育有关。其功能在于催化固醇前体之一纯叶醇（obtusifolio）去甲基化反应，从而转化为14α-羧基甲醛（carboxyaldehyde）。基于底物纯叶醇，在纯叶醇14α去甲基化酶的催化下，转化为植物甾醇，通过皂化处理和有机溶剂萃取，进而在高效液相色谱仪和紫外光谱下（248nm波长）检测分析底物耗损量，来定量测定细胞色素P450亚酶51G1的活性。其反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）毫升

反应液（Reagent B）微升

底物液（Reagent C）微升

皂化液（Reagent D）毫升

萃取液（Reagent E）毫升

流相液（Reagent F）毫升

标准液（Reagent G）微升

产品说明书 1份

保存方式

保存缓冲液（Reagent A）、反应液（Reagent B）、底物液（Reagent C）和标准液（Reagent G）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖；皂化液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品处理的容器

2毫升离心管：用于样品处理的容器

（微型）台式离心机：用于样品处理

恒温水槽或培养箱：用于样品反应孵育

高效液相色谱仪（HPLC）：用于定量测定

实验步骤

一、 样品准备

1．准备好待测样品，例如微粒体蛋白等（注意：建议使用植物组织微粒体组分分离试剂盒-G&VS16020）

2．置于冰槽里融化

一、 背景对照和样品反应

1．分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到2毫升离心管

2．分别加入xx微升反应液（Reagent B）

3．分别加入xx微升底物液（Reagent C）

4．加入50微升待测样品（500微克微粒体蛋白）或缓冲液（Reagent A）

5．枪头抽吸混匀

6．在37℃温度下孵育30分钟

7．分别加入xx微升皂化液（Reagent D）

8．温和涡旋震荡5秒

9．放进80℃恒温水槽孵育60分钟，其间每隔10分钟涡旋震荡5秒一次

10．置于冰槽里冷却1分钟

11．分别加入xx毫升萃取液（Reagent E）

12．温和涡旋震荡5秒

13．放进台式离心机离心10分钟，速度为1300g

14．分别移取上层液相到新的1.5毫升离心管

15．放进40℃干式培养箱挥干

16．分别加入xx微升流相液（Reagent F），混匀

17．即刻进行高效液相色谱分析（注意：如果暂时保存，建议在4℃不超过48小时；-20℃不超过3月）

三、测定准备

1．开启仪器预热15分钟

2．根据下表设置高效液相色谱仪（HPLC）参数

参数	推荐	补充说明
色谱柱	长度：15cm 直径：3.9mm	Waters仪器或 Agilent仪器
固定相	ODS
流动相	流相液（Reagent F）	参见运行程序
流速	1.5毫升/分钟
注射容量	50微升	25微升至100微升
检测	紫外
波长	246nm
柱温	25℃
出峰时间（retention）	30分钟（纯叶醇）	参考
运行时间	40分钟	参考

3．运行程序

运行时段	程序	时间
开机后预运行	100% 流相液（Reagent F）	总10分钟
检测运行时段	100% 流相液（Reagent F）	0至40分钟
关机前运行	100% 流相液（Reagent F）	总10分钟

四、 标准样品配制

1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2．分别加入xx微升流相液（Reagent F）到1至5号管

3．移取xx微升标准液（Reagent G）到1号管，混匀

4．小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent G）到2号管，混匀

5．小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent G）到3号管，混匀

6．小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent G）到4号管，混匀

7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

管号	流相液（Reagent E）	标准液（Reagent G）	标准纯叶醇浓度
1	xx微升	xx微升	25微摩尔/升
2	xx微升	xx微升1号管	12.5微摩尔/升
3	xx微升	xx微升2号管	6.25微摩尔/升
4	xx微升	xx微升3号管	3.125微摩尔/升
5	xx微升	0	0

五、色谱分析

1．将上述配制的标准液（Reagent G）、待测样品和背景对照放进冰槽里等待

2．每次（每个样品）注射50微升

3．按照检测运行程序每次（每个样品）运行40分钟

4．获得色谱波峰图：波峰面积（peak area）或峰值，保存记录

六、计算活性

1）背景对照和待测样本纯叶醇浓度计算

1．方法一：通过仪器中的软件进行测算

2．方法二：构建标准曲线：纵座标（Y轴）为波峰面积（peak area）；横座标（X轴）为标准纯叶醇浓度（微摩尔/升），根据标准曲线获得待测样品和背景对照对应纯叶醇浓度（微摩尔/升）

3．方法三：公式计算（选择单一浓度的标准液）

样本纯叶醇浓度（微摩尔/升）=【样本波峰面积（peak area）X标准纯叶醇浓度】÷对应标准纯叶醇浓度的波峰面积

2）样本酶活性计算

【背景对照—待测样本纯叶醇浓度（微摩尔/升）】÷30（反应时间；分钟）＝纳摩尔/分钟/毫升

转化：纳摩尔/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/分钟/毫克

注意事项

1．本产品为25次操作，包括标准液

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，标准液测定只需1次

4．试剂具有挥发性，注意密闭瓶盖或使用封口膜

5．如果酶活性过低，可以增加反应时间至60分钟

6．皂化液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全

7．建议使用流相液（Reagent F）作为阴性对照或作为基准线

8．色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等

9．用户可以使用已知浓度的标准液（Reagent G）作为内参标准加入到样品中，然后进行萃取，检测回收率（recovery）

10．纯叶醇的出峰时间（retention）以用户操作时，使用的标准液（Reagent G）实际出峰为准

11．建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为500微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒G&VS30030.1）

12．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13．细胞色素P450亚酶51G1单位活性定义为：在37℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够耗损1纳摩尔纯叶醇所需的酶量作为一个活性单位

14．本公司提供系列毒理学检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

单组份订购信息

编号名称规格

G&VS18080.1 植物细胞色素P450亚酶51G1活性高效液相色谱法定量检测试剂盒 20次

G&VS18080.1A 缓冲液（Reagent A）毫升

G&VS18080.1B 反应液（Reagent B）毫升

G&VS18080.1C 底物液（Reagent C）微升

G&VS18080.1D 皂化液（Reagent D）毫升

G&VS18080.1E 萃取液（Reagent E）毫升

G&VS18080.1F 流相液（Reagent F）毫升

G&VS18080.1G 标准液（Reagent G）毫升

试剂盒订购信息

产品编号	名称	规格
G&VS16020	植物组织微粒体分离试剂盒	20次
G&VS18080.1	植物细胞色素P450亚酶51G1（Obtusifolio 14α-demethylase）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18080.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶51G1（Obtusifolio 14α-demethylase）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18081.1	植物细胞色素P450亚酶71A12（PYRAZOXYFEN）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18081.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶71A12（PYRAZOXYFEN）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18082.1	植物细胞色素P450亚酶71A13（INDOLE ACETALDOXIME）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18082.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶71A13（INDOLE ACETALDOXIME）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18083.1	植物细胞色素P450亚酶71B7（ETHOXYCOURMARIN）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18083.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶71B7（ETHOXYCOURMARIN）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18084.1	植物细胞色素P450亚酶71B15（DIHYDROXYCAMALEXIC ACID）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18084.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶71B15（DIHYDROXYCAMALEXIC ACID）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18085.1	植物细胞色素P450亚酶71D15（LIMONENE）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次
G&VS18085.2	体外非细胞系统植物细胞色素P450亚酶71D15（LIMONENE）活性高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒	20次