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谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书

发布时间：2024/7/4 9:14:07 阅读次数：104

一、产品简介：
谷胱甘肽过氧化物酶（GPx ，EC 1. 11. 1.9）代表一种具有过氧化物酶活性的酶家族，在保护生物免受氧化损伤中起重要作用。以往以过氧化氢为底物进行检测，则会受到分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的干扰，本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(Cum-OOH)不会被过氧化氢酶分解，因而可以特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。因此本试剂盒可以定量检测总谷胱甘肽过氧化物酶。
GSH 和 DTNB 反应产生黄色物质，后者在 412nm 下有最大吸收峰，而 GSH-Px 催化有机过氧化物试剂 (Cum-OOH)氧化 GSH ，使 GSH 量减少，GSH 量减少越多，反应混合液黄色越浅，则 GSH-Px 活性越大；反之，黄色越深，GSH-Px 活性越低。

二、试剂盒组分与配制
试剂名称      规格                   保存要求       备注
提取液 60mL× 1 瓶           4℃保存
试剂一      4mL× 1 瓶       4℃保存
试剂二      2mL× 1 瓶       4℃保存
试剂三      40mL× 1 瓶           4℃保存
试剂四      20 mL× 1 瓶      4℃保存
试剂五      4 mL× 1 瓶 4℃保存    若冷藏后呈固体状态，可 25℃水浴 5min 融化即可。
标准品粉体mg× 1 支      4℃保存   若重新做标曲，则用到该试剂。

三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、低温离心机、移液器、研钵。四、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0. 1g 组织（水分充足样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴匀浆(或使用各类常见电动匀浆器) 。4ºC ×12000rpm 离心 10min ，取上清待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各类常见电动匀浆器) 。4ºC 约 12,000rpm 离心 10min ，取上清待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500~ 1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2 、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30 min ，调节波长到 412 nm ，蒸馏水调零。
② 试剂一到五在 25℃水浴中预热 30min ，在 EP 管中依次加入：

试剂名称(µL）   测定管   空白管
试剂一                 80           80
样本                    80
蒸馏水                                80
试剂二                 40          40
25 °条件下反应 5min (严格控制时间）

试剂三   800       800
12000rpm 离心 10min,上清液待测

④ 显色反应：在 1mL 玻璃比色皿中依次加入：
试剂名称(µL）         测定管   空白管
上述步骤的上清液   320   320
试剂四                  400         400
试剂五                     80      80
反应 2min 后，于 412nm 处读取吸光值 A，△A= A 空白管-A 测定管。
【注】：1. 最后一步的显色反应，务必在 5min 之内读取吸光值。若ΔA 在零附近，可增大加样量 V1（如增至 160μL，则试剂三相应减少，总体积不变），或增加第③步反应时间 T（如由 5min 增至 15min或更长），或增加样本质量 W。则改变后的 V1 和 T 和 W 需要代入公式重新计算。

五、结果计算：
1.标准曲线：y = 5.3806x + 0.0008 。x 是 GSH 摩尔浓度：μmol/mL ，y 为吸光值 ΔA 。
2. 按蛋白浓度计算：
活性单位定义：在 25ºC 反应条件下，每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/mg prot)=[(△A-0.0008)÷5.3806× 103 ×V2] ÷(Cpr×V1)÷T ×D = 464.6 ×(△A-0.0008)÷Cpr×D
3. 按样本质量计算：
活性单位定义：在 25ºC 反应条件下，每克样本每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/g 鲜重)=[(△A-0.0008)÷5.3806× 103 ×V2]÷(W×V1÷V)÷T ×D =464.6 ×(△A-0.0008)÷W ×D
4. 按细胞数量计算：
酶活定义：在 25ºC 反应条件下，每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol/min/104 cell)=[(△A-0.0008)÷5.3806× 103 ×V2]÷(细胞数量×V1÷V)÷T ×D
=464.6 ×(△A-0.0008)÷细胞数量×D
5. 按液体体积计算：
活性单位定义：在 25ºC 反应条件下，每毫升液体每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol/min/mL)=[(△A-0.0008)÷5.3806× 103 ×V2]÷V1÷T ×D=464.6 ×(△A-0.0008)×D
V---提取液体积，1 mL；       V1---加入反应体系中上清液体积，80μL=0.08 mL；
V2---反应阶段的反应总体积，1000µL= 1mL；    D----稀释倍数，未稀释即为 1；
W---样本质量，g；    GSH 分子量---307.3；     T---反应时间，5min；
Cpr---上清液蛋白浓度（mg/mL）；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：
1. 制备标准品母液（0.25µmol/mL）：临用前甩几下使粉体落入底部，再加入 1.6mL 蒸馏水溶解，并用蒸馏水稀释 10 倍的标准品母液（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2. 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 µmol/mL。
3. 显色反应阶段，在 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中依次加入：320μL 标准品+400μL 试剂四+80μL 试剂五，反应 2min 后于 412nm 波长读取 A，依据结果制作标准曲线。