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谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书

发布时间：2024/7/4 9:16:46 阅读次数：219

本试剂盒仅供科研使用

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书

一、产品简介：
谷胱甘肽过氧化物酶（GPx ，EC 1. 11. 1.9）代表一种具有过氧化物酶活性的酶家族，在保护生物免受氧化损伤中起重要作用。以往以过氧化氢为底物进行检测，则会受到分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的干扰，本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(Cum-OOH)不会被过氧化氢酶分解，因而可以特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。因此本试剂盒可以定量检测总谷胱甘肽过氧化物酶。
GSH 和 DTNB 反应产生黄色物质，后者在 412nm 下有最大吸收峰，而 GSH-Px 催化有机过氧化物试剂 (Cum-OOH)氧化 GSH ，使 GSH 量减少，GSH 量减少越多，反应混合液黄色越浅，则 GSH-Px 活性越大；
反之，黄色越深，GSH-Px 活性越低。

二、试剂盒组分与配制：
试剂名称       规格                  保存要求      备注
提取液   100mL× 1 瓶      4℃保存
试剂一   8mL× 1 瓶                4℃保存
试剂二   4mL× 1 瓶                4℃保存
试剂三   80mL× 1 瓶              4℃保存
试剂四   10 mL× 1 瓶             4℃保存
试剂五   2mL× 1 瓶                4℃保存      若冷藏后呈固体，可 25℃水浴 5min融化即可。
标准品   粉体 mg× 1 支          4℃保存      若重新做标曲，则用到该试剂。

三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0. 1g 组织（水分充足样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴匀浆(或使用各类常见电动匀浆器)。4ºC 约 12,000rpm 离心 10min ，取上清待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，在 4 ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各类常见电动匀浆器) 。4 ºC 约 12,000rpm 离心 10min ，取上清待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500~ 1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2 、上机检测：
① 酶标仪预热 30 min ，调节波长到 412 nm（若无此波长，可在 420nm 下检测）。
② 用排枪操作，以减小各孔间因加入试剂时间先后导致的误差。
③ 试剂一到五在 25℃水浴中预热 30min ，在 EP 管中依次加入：

试剂名称(µL）   测定管   空白管
试剂一                   80         80
样本                      80
蒸馏水                                 80

试剂二   40   40
25℃条件下反应 5min (严格控制时间）

试剂三   800   800
若有沉淀，需 12000rpm 室温离心 10min,上清液待测。
④显色反应：在 96 孔板中依次加入：

试剂名称(µL）       测定管   空白管
上述步骤的上清液   80         80
试剂四                      100      100
试剂五                       20       20
反应 2min 后，于 412nm 波长读取吸光值 A，△A=A 空白管-A 测定管。
【注】：1. 最后一步的显色反应，务必在 5min 之内读取吸光值。若ΔA 在零附近，可增大加样量 V1（如增至 160μL，则试剂三相应减少，总体积不变），或增加第③步反应时间 T（如由 5min 增至 15min或更长），或增加样本质量 W。则改变后的 V1 和 T 和 W 需要代入公式重新计算。

五、结果计算：
1.标准曲线：y = 3.6568x - 0.0103 。x 是 GSH 摩尔浓度： μmol/mL ，y 为吸光值 ΔA 。
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：在 25ºC 反应条件下，每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(Cpr×V1)÷T ×D = 683.7 ×(△A+0.0103)÷Cpr×D
3. 按样本质量计算：
酶活定义：在 25ºC 反应条件下，每克样本每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/g 鲜重)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(W×V1÷V)÷T ×D = 683.7 ×(△A+0.0103)÷W ×D
4. 按细胞数量计算：
酶活定义：在 25ºC 反应条件下，每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(细胞数量×V1÷V)÷T ×D
=683.7 ×(△A+0.0103)÷细胞数量×D
5. 按液体体积计算：
活性单位定义：在 25ºC 反应条件下，每毫升液体每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol /min/mL)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷V1÷T ×D=683.7 ×(△A+0.0103)×D
V---提取液体积，1 mL；       V1---加入反应体系中上清液体积，80μL=0.08 mL；
V2---反应阶段的反应总体积，1000µL= 1mL；     D---稀释倍数，未稀释即为 1；
W---样本质量，g；       GSH 分子量---307.3； T---反应时间，5min；
Cpr---上清液蛋白浓度（mg/mL）；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：
1. 制备标准品母液（0.25µmol/mL）：临用前甩几下使粉体落入底部，再加入 1.6mL 蒸馏水溶解，
并用蒸馏水稀释 10 倍的标准品母液（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2. 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度：0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 µmol/mL。
3. 显色反应阶段，在 96 孔板中依次加入：80μL 标准品+100μL 试剂四+20μL 试剂五，反应 2min 后，于 412nm 波长读取吸光值 A，依据结果即可制作标准曲线。