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谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒说明书

发布时间:2024/7/4 9:16:46      阅读次数:23

本试剂盒仅供科研使用

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒说明书

一、产品简介:
谷胱甘肽过氧化物酶(GPx ,EC 1. 11. 1.9)代表一种具有过氧化物酶活性的酶家族,在保护生物免受氧 化损伤中起重要作用。以往以过氧化氢为底物进行检测,则会受到分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的 干扰,本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(Cum-OOH)不会被过氧化氢酶分解,因而可以特异地检测出谷胱 甘肽过氧化物酶的活力。 因此本试剂盒可以定量检测总谷胱甘肽过氧化物酶。
GSH 和 DTNB 反应产生黄色物质,后者在 412nm 下有最大吸收峰,而 GSH-Px 催化有机过氧化物试剂 (Cum-OOH)氧化 GSH ,使 GSH 量减少,GSH 量减少越多,反应混合液黄色越浅,则 GSH-Px 活性越大;
反之,黄色越深,GSH-Px 活性越低。

二、试剂盒组分与配制:
试剂名称       规格                  保存要求      备注
提取液    100mL× 1 瓶            4℃保存    
试剂一    8mL× 1 瓶                4℃保存    
试剂二    4mL× 1 瓶                4℃保存    
试剂三    80mL× 1 瓶              4℃保存    
试剂四    10 mL× 1 瓶             4℃保存    
试剂五    2mL× 1 瓶                4℃保存      若冷藏后呈固体,可 25℃水浴 5min融化即可。
标准品    粉体 mg× 1 支          4℃保存      若重新做标曲,则用到该试剂。

三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:称取约 0. 1g 组织(水分充足样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,在 4ºC  或冰浴匀浆(或使用各类常见电动匀浆器)。4ºC 约 12,000rpm 离心 10min ,取上清待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~ 10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞 加入 1mL 提取液 ,在 4 ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各类常见电动匀浆器) 。4 ºC 约 12,000rpm 离心 10min ,取上清待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~ 1000:1 的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2 、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min ,调节波长到 412 nm(若无此波长,可在 420nm 下检测)。
② 用排枪操作, 以减小各孔间因加入试剂时间先后导致的误差。
③ 试剂一到五在 25℃水浴中预热 30min ,在 EP 管中依次加入:

试剂名称(µL)    测定管     空白管
试剂一                   80         80
样本                      80    
蒸馏水                                 80

试剂二    40    40
25℃条件下反应 5min (严格控制时间)

试剂三    800    800
若有沉淀,需 12000rpm 室温离心 10min,上清液待测。
④显色反应:在 96 孔板中依次加入:

试剂名称(µL)       测定管    空白管
上述步骤的上清液    80         80
试剂四                      100      100
试剂五                       20       20
反应 2min 后,于 412nm 波长读取吸光值 A,△A=A 空白管-A 测定管。
【注】 :1.  最后一步的显色反应,务必在 5min 之内读取吸光值。若ΔA 在零附近,可增大加样量 V1(如增至 160μL,则试剂三相应减少,总体积不变),或增加第③步反应时间 T(如由 5min  增至 15min或更长),或增加样本质量 W。则改变后的 V1 和 T 和 W 需要代入公式重新计算。

五、结果计算:
1.标准曲线:y = 3.6568x - 0.0103 。x 是 GSH 摩尔浓度: μmol/mL ,y 为吸光值 ΔA  。
2.  按蛋白浓度计算:
酶活定义:在 25ºC 反应条件下,每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(Cpr×V1)÷T ×D = 683.7 ×(△A+0.0103)÷Cpr×D
3.  按样本质量计算:
酶活定义:在 25ºC 反应条件下,每克样本每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。
GPx 酶活(nmol/min/g  鲜重)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(W×V1÷V)÷T ×D = 683.7 ×(△A+0.0103)÷W ×D
4.  按细胞数量计算:
酶活定义:在 25ºC 反应条件下,每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷(细胞数量×V1÷V)÷T ×D
=683.7 ×(△A+0.0103)÷细胞数量×D
5.  按液体体积计算:
活性单位定义:在 25ºC 反应条件下,每毫升液体每分钟氧化 1nmol GSH 为 1 个酶活单位。 GPx 酶活(nmol /min/mL)=[(△A+0.0103)÷3.6568× 103 ×V2]÷V1÷T ×D=683.7 ×(△A+0.0103)×D
V---提取液体积,1 mL;       V1---加入反应体系中上清液体积,80μL=0.08 mL;
V2---反应阶段的反应总体积,1000µL= 1mL;     D---稀释倍数,未稀释即为 1;
W---样本质量,g;       GSH 分子量---307.3;  T---反应时间,5min;
Cpr---上清液蛋白浓度(mg/mL);建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程:
1. 制备标准品母液(0.25µmol/mL):临用前甩几下使粉体落入底部,再加入 1.6mL 蒸馏水溶解,
并用蒸馏水稀释 10 倍的标准品母液(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2. 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度:0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 µmol/mL。
3. 显色反应阶段,在 96 孔板中依次加入:80μL 标准品+100μL 试剂四+20μL 试剂五,反应 2min 后,于 412nm 波长读取吸光值 A,依据结果即可制作标准曲线。


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