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过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书

发布时间:2024/7/4 9:18:21      阅读次数:17

微量法
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

规 格 :100T/96S
产品内容:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 125μL×1 瓶,4℃保存。

产品说明 :
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的 H2O2  清除酶,在活 性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能够分解 H2O2 ,使反应溶液 240nm 下的吸光度随反应时 间而下降,根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。

需自备的仪器和用品 :
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔(UV 板)、研钵、 冰和蒸馏水

操作步骤:
一、粗酶液提取:
1 、细菌、细胞或组织样品的制备
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声 波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s ,间隔 10s ,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min ,取上清, 置冰上待测。称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min ,取上清,置冰上待 测。
2 、血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤:
1 、 分光光度计或酶标仪预热 30min  以上,调节波长至 240nm ,蒸馏水调零。
2 、CAT 检测工作液的配制:用时在试剂二中加入 25mL 试剂一,充分混匀,作为工作液。 3 、测定前将 CAT 检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4 、准备96孔UV 板一块(非普通酶标板,普通酶标板只能透过可见光,不能透过紫外光,检测波长 小于 340nm务必使用UV 板)。
5 、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,立即混匀并计时,记录 240nm 下初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值 A2 。计算ΔA =A1-A2。

三、CAT 活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1 、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。 CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷V 样÷T=459×ΔA
2 、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷ (Cpr×V 样) ÷T=459×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=459×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。 CAT(U/104 cell) =[ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T =0.917×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4  L;ε :H2O2  摩尔消光系数,4.36×104 L/ mol /cm;d:比色皿光径, 1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W: 样本鲜重,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万;109 :单位换算系数, 1 mol=109 nmol。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1 、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。 CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷V 样÷T=764.5×ΔA
2 、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷ (Cpr×V 样) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=764.5×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2  降解定义为一个酶活力单位。 CAT(U/104 cell)= [ΔA×V 反总÷  ( ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=1.529×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4  L;ε :H2O2  摩尔消光系数,4.36×104  L / mol/ cm;d:96 孔板光径, 0.6cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W: 样本鲜重,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万;109 :单位换算系数, 1 mol=109 nmol。

注意事项:
出现负值怎么办? 首先检查吸光值是否超过 3,如果超过3很可能是没有用UV 板,请换用 UV 板。 如果未超过 3,仍然出现负值则检查反应过程是否产生气泡,气泡多说明酶活性太高,气泡影响 产 生了负值,可以将样本用提取液稀释 10 倍后再检测。如果稀释样本或反应体系没有产生 气泡仍然 出现较小的负值,说明该样本测不到该酶活。


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