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还原糖含量试剂盒说明书微板法

发布时间:2024/7/4 9:25:36      阅读次数:10

本试剂盒仅供科研使用

还原糖含量试剂盒说明书
( 微板法 96 样)

一、产品简介:
还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄 糖、果糖和麦芽糖等,是最常见的单糖和双糖。
在碱性条件下,DNS 试剂与还原糖共热生成棕红色氨基化合物,经过 480nm 到 540nm 波长扫描发现在 500nm 有特征吸收峰;在一定的浓度范围内,还原糖含量与 500nm 吸光度成线性关系,根据标准曲线,即可求出样品中还原糖的量。

二、测试盒组成和配制:
试剂名称    规格                     保存要求     备注
试剂一    液体 12mL× 1 瓶       4℃保存    
标准品    粉体 mg× 1 支           4℃保存      若重新做标曲,则用到该试剂

三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液器、研钵、乙醇、蒸馏水。

四、还原糖含量检测:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费!
1 、样本制备:
(1)组织样本:
称取 0. 1g 样本(若是干样,如烘干烟叶等可取 0.05g;若是水分充足的样本可取 0.2g), 先加入 0.8mL 的 80%乙醇(自备:取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸馏水中),冰浴匀浆,倒入 有盖离心管中,再用 80%乙醇冲洗研钵并转移至同一 EP 管中,使 EP 管中粗提液终体积 定容为 1.5mL(若用自动研磨机可直接加入 1.5mL 的 80%乙醇研磨);置 50℃水浴 20min  (封口膜缠紧,防止液体散失,且间隔 2min振荡混匀一次),冷却后(若有损失,可加 80%乙醇补齐至 1.5mL),12000rpm ,室温离心 10min ,取上清液备用。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~ 10 的比例进行提取
(2)液体样本:
澄清的液体样本直接检测,若浑浊则需 12000rpm ,室温离心 10min ,取上清液备用。

2、上机检测:
(1)酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 500nm。
(2)调节水浴锅至 95℃。
(3)上清液稀释:可先取 2 个样本检测,确定适合本批样本的稀释浓度 D:叶片类样本可
稀释 10 倍,含糖量高的果肉类样本可稀释 20 倍左右。
(4)在 EP 管中加入下列试剂:
试剂(μL)    测定管    空白管(仅做一次)
样本            100    
蒸馏水                       100
试剂一           100      100
混匀,在 95℃水浴中加热 10min(盖紧封口,防止水分散失),
取出后立即过冷水冷却至室温。
蒸馏水    1000    1000
混匀,取 200μL  于 96 孔板中,500nm 读取吸光值 A,
△A=A 测定-A 空白。
【注】:若△A 值大于 1 ,样本可用蒸馏水再稀释,稀释倍数 D 代入计算公式计算。 五、结果计算:
1 、 标准曲线方程为 y = 1.0026x-0.0324;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值△A。
2 、按样本重量计算:
还原糖(mg/g 重量)=[(△A+0.0324)÷1.0026×V1]÷(W×V1÷V)×D
= 1.496×(△A+0.0324)÷W×D
3 、按质量分数(%)计算:
还原糖(%重量)=[(△A+0.0324)÷1.0026×V1]÷(W×V1÷V)×10-3 ×100%
=[0. 1496×(△A+0.0324)÷W×D]%
4 、按液体体积计算:
还原糖(mg/mL)=(△A+0.0324)÷1.0026×D
=0.997×(△A+0.0324)×D
V---样品提取液总体积,1.5mL;
V1---测定时所取样本的体积,0. 1mL;
W---样本质量,g;
D--- 自行稀释倍数,未稀释即为 1。

附:标准曲线制作过程:
1     制备标准品母液(1mg/mL): 向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天 内用且-20℃保存)。
2     把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL 。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。
3     依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。


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