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还原糖含量试剂盒说明书微板法

发布时间：2024/7/4 9:25:36 阅读次数：122

本试剂盒仅供科研使用

还原糖含量试剂盒说明书
（微板法 96 样）

一、产品简介：
还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、果糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖。
在碱性条件下，DNS 试剂与还原糖共热生成棕红色氨基化合物，经过 480nm 到 540nm 波长扫描发现在 500nm 有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 500nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。

二、测试盒组成和配制：
试剂名称   规格                     保存要求   备注
试剂一   液体 12mL× 1 瓶   4℃保存
标准品   粉体 mg× 1 支       4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂

三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液器、研钵、乙醇、蒸馏水。

四、还原糖含量检测：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1 、样本制备：
（1）组织样本：
称取 0. 1g 样本（若是干样，如烘干烟叶等可取 0.05g；若是水分充足的样本可取 0.2g），先加入 0.8mL 的 80%乙醇（自备：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸馏水中），冰浴匀浆，倒入有盖离心管中，再用 80%乙醇冲洗研钵并转移至同一 EP 管中，使 EP 管中粗提液终体积定容为 1.5mL（若用自动研磨机可直接加入 1.5mL 的 80%乙醇研磨）；置 50℃水浴 20min （封口膜缠紧，防止液体散失，且间隔 2min振荡混匀一次），冷却后（若有损失，可加 80%乙醇补齐至 1.5mL），12000rpm ，室温离心 10min ，取上清液备用。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例进行提取
（2）液体样本：
澄清的液体样本直接检测，若浑浊则需 12000rpm ，室温离心 10min ，取上清液备用。

2、上机检测：
（1）酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 500nm。
（2）调节水浴锅至 95℃。
（3）上清液稀释：可先取 2 个样本检测，确定适合本批样本的稀释浓度 D：叶片类样本可
稀释 10 倍，含糖量高的果肉类样本可稀释 20 倍左右。
（4）在 EP 管中加入下列试剂：
试剂(μL）   测定管   空白管（仅做一次）
样本      100
蒸馏水         100
试剂一           100      100
混匀，在 95℃水浴中加热 10min（盖紧封口，防止水分散失），
取出后立即过冷水冷却至室温。
蒸馏水   1000   1000
混匀，取 200μL 于 96 孔板中，500nm 读取吸光值 A，
△A=A 测定-A 空白。
【注】：若△A 值大于 1 ，样本可用蒸馏水再稀释，稀释倍数 D 代入计算公式计算。五、结果计算：
1 、标准曲线方程为 y = 1.0026x-0.0324；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值△A。
2 、按样本重量计算：
还原糖（mg/g 重量）＝[(△A+0.0324)÷1.0026×V1]÷(W×V1÷V)×D
= 1.496×(△A+0.0324)÷W×D
3 、按质量分数（%）计算：
还原糖（%重量）=[(△A+0.0324)÷1.0026×V1]÷(W×V1÷V)×10-3 ×100%
=[0. 1496×(△A+0.0324)÷W×D]%
4 、按液体体积计算：
还原糖（mg/mL）＝(△A+0.0324)÷1.0026×D
=0.997×(△A+0.0324)×D
V---样品提取液总体积，1.5mL；
V1---测定时所取样本的体积，0. 1mL；
W---样本质量，g；
D--- 自行稀释倍数，未稀释即为 1。

附：标准曲线制作过程：
1     制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2     把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL 。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3     依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。