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2×染料法 Tth qRT-PCR MasterMix说明书

发布时间：2024/7/17 16:16:25 阅读次数：145

CAT#:JW-990103-1 低温运输，-20℃保存

产品及特点
本产品是基于 Tth DNA 聚合酶的荧光染料法 RT-PCR MasterMix ，它含有经
过优化的缓冲液组分、Tth DNA 聚合酶、dNTPs、 MgCl2、 SYBR Green I 等所有实时定量 RT-PCR 所需要的成分。与常用的 MMLV-Taq DNA 酶 RT-PCR 体系相比，它们的区别如下：
本产品具有下列特点：
1.   方便，用户只需准备模板、引物即可以进行实时定量 RT-PCR 实验。
2.   产品为 2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.   60-70℃进行 RT-PCR ，避免了 RNA 二级结构打不开问题和非特异扩增问题。
4.   各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
5.   本规格有 1mL ，足够 100 次 20uL 体系的染料法荧光定量 RT-PCR。
6.   比进口同类产品性价比更高。
7.   本系列产品只可用于科研。

规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成分                                                                     编号      规格       包装
2×染料法 Tth qRT-PCR MasterMix                  990103      1 mL       1.5mL 棕色管
使用手册                                                         990103sc       1 份       无

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：RNA 模板、引物、超纯水。

使用方法
1.   按下表设置染料法 Tth RT-PCR 反应，以一个样本为例：
成分                                                      样品管            阴性对照          阳性对照
2×染料法 Tth qRT-PCR MasterMix            10 μL            10 μL              10 μL
自备引物 1（ 10μM）                              1μL          1μL                   1μL
自备引物 2（ 10μM）                                1μL              1μL            1μL
自备模板 RNA（ 100ng-1μg）                  1-2μL
阳性对照 RNA 模板（ 100ng-1μg）                                1-2μL
补超纯水到                                                  20μL            20μL            20μL
2.   放入荧光 PCR 仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一般需要根据靶分子长度，引物的 Tm值等进行调节。一般选择三步法 PCR：

步骤                                    温度                时间
逆转录（ RT 步骤）       60-70℃               30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性                             95℃                3 min
PCR（ 35-45 次循环）   95℃                   15 sec
                                      55-65℃                15-30 sec
                                  72℃                     30 sec（采集 SYBR 通道的荧光信号）
溶解曲线分析                          按 PCR 厂家建议进行

如果引物 Tm值接近 60℃ , 也可以选择两步法 PCR：
步骤                                           温度              时间
逆转录（ RT 步骤）                   60-70℃       30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性                                         95℃         3 min
PCR（ 35-45 次循环）               95℃         15 sec
                                                  60℃       60 sec（采集 SYBR 通道的荧光信号）
溶解曲线分析                            按 PCR 厂家建议进行
3.   定量分析数据处理：根据溶解曲线分析剔除假阳性样本。如果样本经过溶解曲线分析，其数据有效，则进行定量分析。以 6 个 10 倍稀释的标准曲线样本的浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
4.   定性分析数据处理：根据溶解曲线分析剔除假阳性样本。如果样本经过溶解曲线分析，其数据有效，则进行定型分析。阴性对照 Ct 大于或等于 40（此处为便于叙述姑且以 40 为例，具体设置成多少需要用户根据引物探针的具体情况测试确定）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40 则为阳性。

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