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发布时间：2025/3/10 10:06:13 阅读次数：56
NAD-苹果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）试剂盒说明书
紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2 ，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NAD-ME催化 NAD+还原成 NADH，在340nm下测定 NADH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，4℃保存；用时加2mL蒸馏水充分溶解备用；溶解后 4℃可保存一周。
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加1mL蒸馏水充分溶解备用；现配现用。
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一、二、三和四置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃
（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上（现配现用）。
3、 操作表：
| 试剂名称（μL） | 测定管 |
| 试剂一 | 600 |
| 试剂二 | 225 |
| 试剂三 | 30 |
| 试剂四 | 15 |
| 样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀，立即记录340nm波长下初始吸光度 A1和反应1min后的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1。
注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到 2分钟或 5分钟。
NAD-ME 活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =4823×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T =9.646×ΔA
V 反总：反应体系总体积，9×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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