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发布时间：2025/3/10 10:06:53 阅读次数：63
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒说明书
可见分光光度法
产品内容：
提取液：30mL×1瓶， 4℃保存；
试剂一：液体15 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入1.3 mL双蒸水充分溶解备用，配好后-20 ℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；
试剂三：液体15 mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：液体50 mL×1瓶，4℃保存；
产品简介：
LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD+/NADH之间互变。
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样品测定的准备：
1. 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3. 血清（浆）样品：直接检测。
二、测定操作：
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定（在EP管中加入下列试剂）
| 试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
| 样本 | 50 | 50 |
| 试剂一 | 250 | 250 |
| 试剂二 | 50 |
|
| 蒸馏水 |
| 50 |
充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min
| 试剂三 | 250 | 250 |
充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min
| 试剂四 | 750 | 750 |
充分混匀，室温静置3min，450 nm下测定吸光度，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需要设一个对照管。
LDH活力单位计算：
1. 标准条件下测定的回归曲线， y = 0.725x (x为标准品浓度，μmol/mL；y为对吸光度)。
2. 血清（浆）LDH活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA
3. 细胞、细菌和组织中LDH活力的计算
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (V1×Cpr) ÷T×103 =92×ΔA÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/g鲜重）=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (W ×V1÷V2) ÷T×103 =92×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
LDH（U/104 cell）= [ΔA÷0.725×V 1]÷(500 ×V1÷V2) ÷T×103 =0.184×ΔA÷W
V1：加入反应体系中样本的体积，0.05 mL；V2：加入提取液的体积，1 mL； T：反应时间，15 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g; 500：细胞或细菌总数，500万。
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