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发布时间：2025/3/10 10:08:34 阅读次数：7
NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）试剂盒说明书
可见分光光度法
产品说明：
试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂三：液体1mL×1瓶，-20℃保存。
试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体6 mL×1瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品简介：
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
操作步骤：
一、样品测定的准备：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。
二、测定操作：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1） 试剂四、试剂五和试剂六于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
（2） 在1mL石英比色皿中加入40μL样本、700μL试剂四、100μL试剂五和160μL试剂六，混匀，记录600nm处20s时吸光值A1和 1min 20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
NOX活力单位的计算：
1. 血清(浆)NOX活力的计算
单位的定义：每mL血清(浆)在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA
2. 组织、细菌或细胞中NOX活力的计算
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V反总：反应体系总体积，1mL； V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500万。
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