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发布时间：2025/3/10 10:12:31 阅读次数：38
NADP磷酸酶（NADPase）试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化 NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
测定原理：
NADPase 能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase 活性。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 30 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×5 支，-20℃保存；用时每支加入 1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。
试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。
试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。
试剂五：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六20倍稀释，即取0.5mL试剂六加9.5蒸馏水，充分混匀。
定磷试剂的配制：按 H2O:试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：
1、 酶促反应
| 试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
| 试剂一 | 300 | 300 |
| 试剂二 | 100 | 100 |
| 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5min | ||
| 样本 | 100 |
|
| 蒸馏水 |
| 100 |
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清
2、定磷
|
| 标准管 | 空白管 | 测定管 | 对照管 |
| 0.5μmol/ml 标准磷应用液 | 100 |
|
|
|
| 蒸馏水 |
| 100 |
|
|
| 上清液 |
|
| 100 | 100 |
| 定磷试剂 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 30min，冷却至室温，在 660nm 处，蒸馏水调零，记录各管吸光值。
注意事项：
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase 酶活性计算：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase
活力单位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V 样×Cpr)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：每小时每 g 组织 NADPase 分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase 活力单位。
NADPase (μmol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体
积，0.1mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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