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胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）试剂盒说明书

发布时间：2025/3/10 10:13:23 阅读次数：31

胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）试剂盒说明书

紫外分光光度法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理：

利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应，在 340 nm下测定 NADPH 浓度的增加。

所需的仪器和用品:

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；用时加 550μL 蒸馏水充分溶解备用；溶解后 4℃可保存一周。

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加 550μL 蒸馏水充分溶解备用；现配现用。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一置于 37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）水浴中预热 10min 左右。

3、操作表：

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	750
试剂二	10
试剂三	10
样本	30

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时；混匀，在 340nm 波长下记录20s时的初始吸光度 A1和2min 20s时的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、若 A2-A1 小于 0.005，可延长反应时间到 5min 或 10min。

ICDHc 活力单位的计算：

1、血清（浆）ICDHc 活力的计算:

单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（nmol/min /mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷V 样÷T=2143×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ICDHc 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V 样×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=2143×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（nmol/min /10⁴ ）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=4.285×ΔA

V 反总：反应体系总体积，8×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。