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NADP-苹果酸酶（Malic enzyme，NADP-ME）试剂盒说明书

发布时间：2025/3/10 10:13:46 阅读次数：21

NADP-苹果酸酶（Malic enzyme，NADP-ME）试剂盒说明书

紫外分光光度法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO₂ ，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理：

NADP-ME 催化 NADP+还原成 NADPH，在340nm下测定NADPH 增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；

试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；用时加2mL蒸馏水充分溶解备用；溶解后4℃可保存一周；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加1mL蒸馏水充分溶解备用；现配现用；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三和四置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。

如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上（混合液现配现用）。

3、操作表：

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	600
试剂二	225
试剂三	30
试剂四	15
样本	30

将上述试剂按顺序加 1mL石英比色皿中，混匀，立即记录340 nm波长下初始吸光度 A1和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到2分钟或5分钟。

NADP-ME 活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹ ]÷(V 样×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =4823×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmol/min /10 4 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9 ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =9.646×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。